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Ingex TGIRT™-III Enzyme 說明書

　更新時間：2018-05-30　點擊量：3396

 

TGIRT™-III Enzyme

 

規格：

 10 Reactions (TGIRT10)

50 Reactions (TGIRT50)

5 x 50 µl (TGIRT5x50)

10 x 50 µl (TGIRT10x50)

 

單位定義(yi) ：

 

TGIRT的一個(ge) 單元® -III逆轉錄酶（RT）活性是酶的使用聚在60℃下聚合1納摩爾的dNTP的在1分鍾（RA）所需要的量/寡（dT）42作為(wei) 底物。

酶濃度：

 

200單位/μl

酶儲(chu) 存緩衝(chong) 液：

 

20mM Tris-HCl（pH 7.5），500mM KCl，1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油

酶屬性和新穎活動：

 

比逆轉錄逆轉錄酶更高的熱穩定性，持續合成能力和保真度，允許從(cong) 高度結構化或重度修飾的RNA （例如tRNA）和包含富含GC的重複擴增的RNA合成全長，端對端c 。1-9,12,15,18

新型端對端模板轉換活動，可在反轉錄過程中連接RNA-seq或PCR適配器，並且無需單獨的RNA 3'-適配器連接步驟。1這種模板轉換活性極大地促進了鏈特異性RNA-seq文庫的構建，而且比使用隨機六聚體(ti) 引物或使用RNA連接酶進行銜接子連接的方法具有更小的偏差。1,7,8

從(cong) 退火引物合成c。將退火的引物應具有推測的T 米 > 60的直徑： C.酶與(yu) 反應底物混合，在室溫下，通過加入dNTP的反應開始30分鍾的預溫育，建議。新應用的zui宜條件應該通過測試25-450mM NaCl的一係列鹽濃度來確定。

建議用於(yu) 酶的用途：

 

1.全麵的鏈特異性轉錄組分析。8

 

2.全細胞，外泌體(ti) ，血漿和其他無細胞RNA的RNA-seq。7,8,15

 

3.分析miRNA，tRNA和其他小的非編碼RNA。1-9,12,15

 

4. RIP-seq，HITS-CLIP，irCLIP和CRAC用於(yu) 表征RNA-蛋白質相互作用和核糖體(ti) 分析。1,10,11

 

5.通過高通量測序鑒定RNA堿基修飾。4,5,13,​​14

 

6.使用諸如SHAPE和DMS修飾的方法進行全基因組或靶向RNA結構作圖。1,16

 

7.富含GC重複擴增的逆轉錄和定量。18

 

8.長c的合成。1

 

9.RT-qPCR。1

 

10.單鏈-seq。17

 

11.分析FFPE腫瘤樣本（谘詢InGex）。

 

酶的優(you) 點：

 

1.全麵的鏈特異性轉錄組分析。

 

核糖核碎片，通用人類參考RNA樣品的TGIRT®-seq概括了人類轉錄物和穗突起的相對豐(feng) 度，與(yu) 非鏈特異性TruSeq v2相比，並且優(you) 於(yu) 鏈特異性Tru-Seq v3。TGIRT®-seq比TruSeq v3具有更高的鏈特異性，並消除了TruSeq固有的隨機六聚體(ti) 引發的取樣偏差。TGIRT®-seq顯示出更加統一的5'至3'基因覆蓋範圍，並且比TruSeq識別更多的剪接點。TGIRT®-seq能夠在與(yu) 結構化小型ncRNA相同的RNA-seq中同時分析mRNA和lncRNA，包括tRNA，TruSeq數據集基本上不存在tRNA。8

 

 

 

2.全細胞，外泌體(ti) ，血漿和其他細胞外RNA的RNA-seq。

 

快速的處理時間（通過PCR步驟對RNA-seq文庫構建<5小時）; 需要少量的RNA（低ng範圍）; 包括mRNA和lncRNA以及小ncRNA的全麵轉錄譜，包括tRNA，pre-miRNA和其他結構化小型ncRNA的全長讀段; 比常規方法更少的偏差和更大的鏈特異性。7,8,15

 

3.通過TGIRT®模板轉換的RNA-seq文庫構建，如RIP-seq，HITS-CLIP，irCLIP，CRAC，​​核糖體(ti) 譜分析。

 

快速的處理時間（通過PCR步驟對RNA-seq文庫構建<5小時）; 需要少量的RNA（低ng範圍）; 不需要RNA連接酶，通過減少步驟中的步驟來減少偏倚並提率。1,10,11

 

4.比逆轉錄病毒RT更高的熱穩定性，持續合成能力和鏈置換活性。

 

使用錨定寡核苷酸（dT）引物，可以構建RNA聚合腺苷酸化的RNA文庫，與(yu) 沒有ribodepletion步驟的逆轉錄病毒RT相比，具有更均勻的5'至3'覆蓋範圍。1

通過基於(yu) 毛細管電泳的方法（如SHAPE或DMS結構圖）進行RNA結構作圖，其顯著的讀數長度和更少的提前停止時間比逆轉錄病毒RTs更短。1,16

可以分析含有富含GC的重複擴增的RNA模板。18

能夠合成來自tRNA和其他小型結構化/修飾的ncRNA的全長，端對端c，這些逆轉錄病毒RT難以治療。4-9,12-15     

5.人血漿和大腸杆菌  基因組的ss-seq 。

 

通過直接在鏈的3'末端啟動合成，同時連接-seq接頭而不進行末端修複，拖尾或連接，以更簡單的工作流程捕獲的末端。能夠分析核小體(ti) 定位，轉錄因子結合位點，甲基化位點和起源組織。17

 

參考文獻：

 

  1. Mohr, S., Ghanem, E., Smith, W., Sheeter, D., Qin, Y., King, O., Polioudakis, D., Iyer, V.R., Hunicke-Smith, S. Swamy, S., Kuersten, S., and Lambowitz, A.M. Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in c synthesis and next-generation RNA sequencing. RNA 19, 958-970, 2013.
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