CL7 / Im7標簽係統

CL7 / Im7蛋白純化係統基於(yu) 兩(liang) 個(ge) 小蛋白（CL7和Im7）之間形成的超高親(qin) 和力複合物。CL7（16kDa）是與(yu) 靶蛋白融合的標簽，Im7（10 kDa）是與(yu) 瓊脂糖樹脂偶聯的配體(ti) 。

CL7的野生型是CE7 DNase，一種有毒的細菌蛋白。突變被設計成消除其結合和se活性，同時保留了對Im7的超高親(qin) 和力。

係統組成 

CL7標簽

CL7標簽可以在靶蛋白的N或C末端表達。我們(men) 的質粒提供了溶解度標簽，親(qin) 和標簽和切割位點以及多種克隆選項的組合。

在對照實驗中，CL7對溶解度或表達無負麵影響。實際上，CL7改善了在無標簽的大腸杆菌中表達時原本不溶的蛋白質的表達水平和溶解度。當用CL7標簽表達時，幾種臨(lin) 床和治療上相關(guan) 的蛋白質從(cong) 不溶部分轉移到可溶部分。純化變性表達的蛋白質不需要變性劑或從(cong) 包涵體(ti) 重新折疊。

Im7樹脂

Im7樹脂由CL7的結合伴侶(lv) Im7固定在瓊脂糖樹脂上組成。由於(yu) Im7和CL7之間具有高度特異性的親(qin) 和力，脫靶樹脂的結合極少。具有35-40 mg / mL的高樹脂結合能力，可以捕獲大量CL7標記的蛋白。Im7結構域具有很高的彈性，使用Gdn-HCl可使樹脂再生並重複使用多達100次。

洗脫蛋白酶

蛋白酶對於(yu) 從(cong) Im7樹脂柱上洗脫目標蛋白至關(guan) 重要。

TriAltus純化我們(men) 自己的SUMO和PSC蛋白酶，由於(yu) 它們(men) 的超高純度，它們(men) 具有很高的活性。TriAltus提供的兩(liang) 種蛋白酶裂解速度都更快，並且比競爭(zheng) 對手的產(chan) 品便宜。 

例如，如果將60-80 mg的蛋白質與(yu) 5 mL色譜柱結合，則流速為(wei) 0.2 mL / min的20 mL洗脫緩衝(chong) 液中的1 mg蛋白酶將僅(jin) 在1.5-2小時內(nei) 洗脫蛋白質。少量的蛋白酶是如此稀薄，以至於(yu) 可能不需要將其去除。但是，如果需要，可以使用用於(yu) SUMO的His柱和用於(yu) PSC的GST進行拋光步驟。

相撲 

SUMO蛋白酶用於(yu) 洗脫N末端標記的蛋白。它是一種高度特異性的酶，可識別SUMO切割位點的三級結構，並且在切割後不留下氨基酸殘基。它的特異性也使其裂解速度比PSC快。1 ug SUMO可以在30分鍾內(nei) 裂解2 mg底物96％，在40分鍾內(nei) 裂解99％。

PSC 

PSC蛋白酶用於(yu) 切割N或C末端標記的蛋白。它也是高效的：20 ug PSC將在40分鍾內(nei) 以91％的比例裂解2 mg底物，在60分鍾內(nei) 以99％的比例裂解。

1個色譜步驟的簡單純化方案

CL7和Im7的鹽獨立性和高度特異性的結合親(qin) 和力使其可以實現簡單明了的方案。CL7不是在一步中使用His-trap，而是在隨後使用特殊標簽精製蛋白質，而是在一個(ge) 色譜步驟中實現了超高純度。

CL7 / Im7的優勢 

市場上的每種蛋白質純化係統都可以通過其在兩(liang) 個(ge) 參數下的性能來表征：產(chan) 量和純度。CL7 / Im7係統在兩(liang) 個(ge) 方麵都優(you) 於(yu) His-tag和special標簽。

屈服

TriAltus開發了一種用於(yu) 高粘合力樹脂的高效偶聯方法。Im7樹脂的結合能力在35-40 mg / mL範圍內(nei) 。這遠遠優(you) 於(yu) 特殊標簽的樹脂，以及在用於(yu) His-trap的Ni柱的頂端。

純度

純度取決(jue) 於(yu) 蛋白質純化係統對未標記的細胞成分的敏感性。雜質分為(wei) 兩(liang) 類：基於(yu) 標記的靶蛋白/細胞組分相互作用的雜質，以及由於(yu) 細胞組分與(yu) 色譜柱結合的配體(ti) 的非特異性結合而產(chan) 生的雜質。

與靶蛋白的相互作用

在高鹽濃度緩衝(chong) 液的存在下，CL7與(yu) Im7的結合不會(hui) 受到幹擾。較高的鹽緩衝(chong) 液可有​​效地在純化過程中盡早去除雜質，從(cong) 而獲得幹淨的最終產(chan) 品。標簽對約0.2-0.3 M的鹽濃度敏感，導致一步層析後純度低。

非特異性結合

CL7和Im7彼此高度特定。這樣可以防止標簽或配體(ti) 與(yu) 細胞成分（例如和其他蛋白質）之間發生非特異性相互作用。IMAC係統易與(yu) 樹脂中的金屬離子發生非特異性結合。

高耐鹽性和高特異性結合這兩(liang) 個(ge) 因素的結合，可產(chan) 生如此高的純度，以至於(yu) CL7 / Im7係統僅(jin) 需一個(ge) 色譜步驟即可。

成功純化具有挑戰性的蛋白質

多亞基RNA聚合酶

ttRNAP（Thermus嗜熱菌聚合酶）是一個(ge) 大的〜400 kDa的蛋白質用5個(ge) 亞(ya) 基（α 2 ββ'ω）和4個(ge) 結合位點。傳(chuan) 統上，純化需要5個(ge) 連續的色譜步驟才能獲得足夠高的純度以實現高活性。蛋白質的純度與(yu) 其活性直接相關(guan) 。將細胞裂解液加載到1.5 M鹽緩衝(chong) 液中是一步純化的關(guan) 鍵。CL7標簽附著在最大的 β'亞(ya) 基上， 不會(hui) 幹擾亞(ya) 基組裝。 

/ RNA結合蛋白-Cas9

Cas9是CRISPR技術的關(guan) 鍵組成部分。Cas9活性與(yu) 其純度直接相關(guan) ，但通常需要4-5個(ge) 色譜步驟才能達到所需的純度。當Cas9被CL7標記並裝載在1.5 M鹽緩衝(chong) 液中時，在一個(ge) 純化步驟中可以實現99％的純度。該酶在體(ti) 內(nei) 和體(ti) 外試驗中均顯示高活性。

膜蛋白-YidC

YidC是約32 kDa的細菌膜整合酶。*，膜蛋白難以純化，因為(wei) 與(yu) 細胞成分發生疏水性接觸會(hui) 造成汙染。由於(yu) His-tag非特異性結合至其色譜柱，因此在純化的一個(ge) 步驟後會(hui) 存在大量雜質。CL7對Im7的特異性將這些影響降至低值，使純度高達99％。

治療蛋白折疊不良-GCSF，hGH和IFN- α

GCSF，hGH和IFN-α是FDA批準的三種生物製劑。每個(ge) 都有兩(liang) 個(ge) 內(nei) 部半胱氨酸橋，當在沒有標簽的大腸杆菌中表達時通常不溶。純化不溶蛋白通常涉及棘手的重折疊步驟，然後是多個(ge) 色譜步驟。CL7增強了蛋白質的表達，穩定性和折疊性，因此它們(men) 不再表達為(wei) 包涵體(ti) 。