細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書

細胞核蛋白與(yu) 細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書(shu)

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產(chan) 品詳情

 產(chan) 品描述

漿核蛋白的分離提取屬於(yu) 生物學研究的重要實驗之一，對於(yu) 探究細胞中的不同組分以及蛋白在細胞中的定位具有重要的意義(yi) ，促進亞(ya) 細胞蛋白組學發展，提取的核蛋白可以用於(yu) 後續轉錄調控方麵研究，例如Pull Down，EMSA，footprinting等，為(wei) 分子機製深入探索提供可靠技術支持。

基本原理如下：細胞在低滲條件下胞膜會(hui) 發生脹破，釋放漿蛋白，離心得到細胞核沉澱，最後利用高鹽溶液抽提得到核蛋白，本試劑盒利用該原理，優(you) 化配方組分和提取方法提供了一種高效提取漿核蛋白的方法，較大保持蛋白的天然活性，同時漿蛋白與(yu) 核蛋白之間存在極少的交叉汙染，為(wei) 後續研究提供可靠的樣本。本試劑盒隻適用於(yu) 細胞樣品的核漿蛋白提取，每T約適用於(yu) 約一個(ge) 大皿細胞量的提取。

產(chan) 品組成

運輸與(yu) 保存

-20℃保存，一年有效

實驗步驟

1.試劑準備：

室溫溶解試劑盒中三種組分，溶解後混勻冰上放置備用

（1）自備100 mM PMSF母液；

（2）漿蛋白抽提工作液：用細胞漿蛋白抽提試劑A將試劑C稀釋至1X用，臨(lin) 用前加入PMSF母液使其終濃度為(wei) 1mM（現配現用）；

（3）核蛋白抽提工作液：用細胞漿蛋白抽提試劑B將試劑C稀釋至1X用，臨(lin) 用前加入PMSF母液使其終濃度為(wei) 1mM（現配現用）。

2. 收集細胞沉澱

①對於(yu) 貼壁細胞：棄去原來培養(yang) 基，PBS清洗一遍，用細胞刮或消化收集細胞沉澱，盡可能吸淨上清，留下沉澱備用（推薦使EDTA溶液代替胰酶消化，以免胰酶殘留降解目的蛋白；每個(ge) 樣品可用小離心機或原來離心機進行二次離心，充分棄去殘留上清以保證後續提取效果不受影響）；②對於(yu) 懸浮細胞：離心收集細胞，PBS清洗一遍，盡可能吸淨上清，留下沉澱備用。

3. 漿蛋白的提取

（1）約50 μL體(ti) 積的細胞沉澱中加入200 μL細胞漿蛋白抽提工作液，反複吹打混勻十多次至沉澱散離，冰浴10 min後再次吹打混勻十多次，繼續冰浴裂解5 min。

（2）高速劇烈渦旋5s，4℃ 600g離心5 min，此時得到的沉澱為(wei) 細胞核沉澱，上清為(wei) 粗提的漿蛋白，將此上清再次4℃ 12000g離心10 min去除雜質即得到純淨的細胞漿蛋白。

4.核蛋白的提取

（1） 對於(yu) 步驟3-(2)中獲得的細胞核沉澱加入400 μL細胞漿蛋白抽提試劑A（此時使用的試劑A不含試劑C），吹打混勻十多次至沉澱分散，4℃，冰浴5 min 600 g離心5 min，棄去上清保留沉澱，得到的沉澱重複該操作一次，最後盡最大努力棄去上清保留沉澱。

（2）對於(yu) 步驟4-(1)中獲得的沉澱加入100 μL細胞核蛋白抽提工作液，冰浴裂解30min，期間多次渦旋振蕩10-15s以充分裂解（核蛋白裂解後，如果條件允許建議使用超聲以大功率的提取核蛋白，增加蛋白質的溶解度，提高實驗結果一致性，超聲3次，每次5秒，功率90w）。

（3）4℃ 12000g離心10 min收集上清為(wei) 細胞核蛋白。抽提得到的漿核蛋白可立即使用，也可-80℃保存備用。

實驗案例分析

細胞刮收集A549，H1299，Hela三種細胞沉澱樣品，每種細胞約一個(ge) 大皿的細胞量，按照試劑盒使用說明進行核漿蛋白的分離提取，得到的漿蛋白和核蛋白用於(yu) western blot分析，考察其核漿分離效果，結果如下圖所示：

圖3.三種細胞樣品的漿核蛋白western blot分析結果

注意事項

（1）需自備PMSF。PMSF母液用無水乙醇配製，臨(lin) 用前2-3 min內(nei) 加入，以免在水溶液中很快失效；

（2）所有的抽提步驟都需要在冰上或者4℃進行；

（3）本試劑盒隻適用於(yu) 細胞樣品漿核蛋白的提取分離，提取到的蛋白樣品可直接用BCA法進行蛋白濃度測定；

（4）為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套；

（5）本產(chan) 品僅(jin) 作科研用途！