一步法恒溫支原體檢測試劑盒(溶液型)說明書

一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒(溶液型)說明書(shu)

上海起發生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬於(yu) 韦德网站官方入口（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發生物自有品牌，打造優(you) 質的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chan) 業(ye) 鏈中的國產(chan) 生物試劑品質關(guan) 。未來讓每一個(ge) 和我們(men) 一樣擁有民族情懷的企業(ye) ，共同創世界優(you) 秀的中國生物製造企業(ye) ，圓夢中國。

產(chan) 品詳情

產(chan) 品描述

 哺乳動物細胞的培養(yang) ，支原體(ti) （Mycoplasma）汙染是個(ge) 世界性的問題。支原體(ti) 汙染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至錯誤。從(cong) 2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養(yang) 都要進行支原體(ti) 檢測。相信會(hui) 有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體(ti) 檢測要求。

        培養(yang) 法是相對可靠的支原體(ti) 檢測技術，但是該方法非常耗時的，需要數周，不適合作為(wei) 細胞培養(yang) 液中支原體(ti) 汙染的快速檢測。此外，通過固體(ti) 培養(yang) 法無法檢測汙染細胞的一種最常見的支原體(ti) ，即豬鼻支原體(ti) （M.Hyorhinis）。這是因為(wei) 豬鼻支原體(ti) 無法在支原體(ti) 固體(ti) 培養(yang) 基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體(ti) 約占所有支原體(ti) 汙染的20-50%。

        有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體(ti) ，但是該方法靈敏度太低，而且嚴(yan) 重依賴實驗人員的經驗，實驗的穩定性極差。此外，當該方法檢測成陽性時，細胞經常已經嚴(yan) 重汙染。

        培養(yang) 法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體(ti) 檢測方法，但是因為(wei) 其各自都有明顯的缺點，不適合作為(wei) 支原體(ti) 快速檢測的方法。

        本公司目前已經開發出四種不同原理的快速支原體(ti) 檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》、《PCR法支原體(ti) 檢測試劑盒》、《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》和《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》，其各自都有自己的優(you) 缺點。

        《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》使用恒溫基因擴增技術，有明顯的優(you) 點：（1）整個(ge) 檢測過程隻需1小時，大大縮短了檢測時間；（2）未發現細胞培養(yang) 液中的PCR抑製劑會(hui) 抑製恒溫基因擴增，所以一般無需進行樣品的前處理；（3）恒溫基因擴增的靈敏度良好，一般比30個(ge) 循環普通PCR法高；（4）恒溫基因擴增的產(chan) 物無需電泳，可以通過指示劑的顏色變化直接肉眼判斷反應結果；（5）無需用到PCR儀(yi) 、電泳槽、凝膠成像儀(yi) 等儀(yi) 器，整個(ge) 檢測過程隻需一個(ge) 水浴鍋。

        經測試，本試劑盒至少可以檢測以下13種支原體(ti) ：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M. pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis（注：M.為(wei) Mycoplasma的縮寫(xie) ；A.為(wei) Acholeplasma的縮寫(xie) ）。其中，前8種為(wei) 是最常見的汙染細胞的支原體(ti) 種類，約占汙染細胞的支原體(ti) 的98%左右。以上13種約占汙染細胞的支原體(ti) 種類的99%左右。

        《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》的檢測靈敏度：經測試，在每個(ge) 反應管的加入量為(wei) 2 μL的情況下，《一步恒溫法支原體(ti) 檢測試劑盒》的最高檢測靈敏度（即檢測下限）大約在20-400個(ge) copies，即10-200 copies/μL。可以通過離心濃縮、提取支原體(ti) 基因組等措施，其檢測靈敏度可以在此基礎上繼續提高10-100倍。

        由於(yu) 任何一種快速支原體(ti) 檢測方法都無法保證檢測結果100%正確，如果您想得到100%正確的支原體(ti) 檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行幹細胞培養(yang) 的客戶，生產(chan) 血清、胰酶、培養(yang) 液的客戶，出售各種原代培養(yang) 細胞係和腫瘤細胞係的客戶等），任選本公司生產(chan) 的《一步法恒溫支原體(ti) 檢測試劑盒》、《PCR法支原體(ti) 檢測試劑盒》、《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》和《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》中的兩(liang) 種進行檢測，將會(hui) 得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體(ti) 檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。

產(chan) 品組分

（1）溶液1：1150 μL （50次檢測）；

（2）溶液2：55 μL；

（3）溶液3：指示劑，38 μL

（4）陽性支原體(ti) ：50 μL；     

（5）礦物油：1500 μL。

使用方法

使用方法

1. 待測樣品的準備：

     為(wei) 了準確判斷細胞是否有支原體(ti) 的汙染，待測的細胞培養(yang) 液樣品需要取自換液後培養(yang) 2-3天且匯合度在90%左右的細胞培養(yang) 液上清（貼壁細胞）。懸浮培養(yang) 的細胞也需要在換液傳(chuan) 代後，讓細胞生長2-3天再取培養(yang) 液進行檢測。可以按照以下兩(liang) 種方法之一進行樣品的前處理：

方法一：直接檢測（該方法無法去除可能的幹擾物，顯色被幹擾的可能性相對較大）：

（1）取150 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nei) ，在普通台式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，取離心後的上清100 μL用於(yu) 支原體(ti) 檢測，丟(diu) 棄下層剩餘(yu) 的50 μL（含細胞沉澱）。

（2）已經離心去除細胞的待測樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理後再檢測（熱處理後，樣品保存更穩定），具體(ti) 如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內(nei) ，在PCR儀(yi) 上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）後，取上清進行檢測。 

方法二：簡單離心清洗（推薦方法。該方法不僅(jin) 可以濃縮支原體(ti) 從(cong) 而提高檢測的相對靈敏度，還可以去除絕大部分可能的幹擾物，顯色被幹擾的可能性極小。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除幹擾物，可以使用後文注意事項部分的三步離心清洗的方法。）：

（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內(nei) ，在普通台式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心後的上清轉移到另一個(ge) 離心管內(nei) ，丟(diu) 棄細胞沉澱。

（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 minutes，小心吸走全部上清（為(wei) 避免碰到底部沉澱，可以保留底部3-5 μL液體(ti) ），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，隻適合當天或短期內(nei) 檢測使用）重懸沉澱（沉澱中含有支原體(ti) ），吹吸均勻【如果最初使用了1500 μL的樣品而最後用20 μL重懸，則支原體(ti) 濃度大約提高了75倍，相對靈敏度也提高了75倍】。

（3）該重懸後的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理後再檢測（熱處理後，樣品保存更穩定）。熱處理具體(ti) 如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內(nei) ，在PCR儀(yi) 上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）後，取上清進行檢測。

實驗案例分析

  我們(men) 選取了比較有代表性的4種支原體(ti) （分別是：M. hyorhinis，M. fermentans A. laidlawii和M. pirum），使用含相應支原體(ti) 基因片段的質粒載體(ti) ，經定量後，計算出相應的分子數。

        質粒經4倍係列稀釋【從(cong) 4^(0)到4^(-8)】，進行相應的恒溫擴增（每個(ge) 反應管的加入量為(wei) 2μL，每個(ge) 稀釋度做2個(ge) 重複），並對恒溫擴增產(chan) 物進行拍照。恒溫擴增反應的結果下圖所示：

注意事項

1. 請確保樣品加入後，反應之前：陰性、陽性和所有待測樣品的顏色基本一致。如果個(ge) 別樣品，一旦加入，反應管的顏色就與(yu) 陰性、陽性明顯不同，說明其中含有可幹擾本係統正常指示效果的物質，必須先去除。此現象曾經在檢測CHO無血清培養(yang) 基和一些血液製品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液等）上發生過。常見的DMEM、MEM、F12、1640等培養(yang) 基（可以含10%血清）一般不會(hui) 發生該現象。去除方法：（1）離心清洗：取1 mL細胞上清或待測樣品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液），先13000 rpm離心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，小心吸走全部上清（為(wei) 避免碰到底部沉澱，可以保留底部3-5 μL液體(ti) ），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，隻適合當天或短期內(nei) 檢測使用）重懸沉澱，吹吸均勻。該重懸後的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理後再檢測（熱處理後，樣品保存更穩定）。熱處理具體(ti) 如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內(nei) ，在PCR儀(yi) 上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）後，取上清進行檢測。由於(yu) 離心清洗可能導致支原體(ti) 部分丟(diu) 失，如果樣品支原體(ti) 含量很低，可能導致漏檢。（2）使用本公司《支原體(ti) 基因組提取試劑盒》提取支原體(ti) 後進行檢測。通過提取，即可以將所有可能的幹擾物質全部去除，又可以將支原體(ti) 濃縮10-100倍。

2. 由於(yu) 恒溫擴增所用的各種酶強烈依賴溶液中的二價(jia) 離子，待測樣品的EDTA等金屬離子螯合劑隻能微量存在。如果打算用試劑盒提取支原體(ti) （推薦使用本公司《支原體(ti) 基因組提取試劑盒》），請用去離子水或者不含EDTA的5 mM Tris.HCl（pH 8.0-8.8）的緩衝(chong) 液洗脫和溶解。

3. 防汙染注意事項：

（1）恒溫反應體(ti) 係配製的房間（本試劑盒請在有窗戶、通風良好的普通房間操作。請勿在密閉的細胞培養(yang) 間進行該步驟的操作，因為(wei) 細胞培養(yang) 間支原體(ti) 汙染概率很高），與(yu) 用於(yu) 樣品前處理、加陽性對照、樣品的房間一定要分開。

（2）強烈建議使用濾芯吸頭吸取相關(guan) 溶液和陽性支原體(ti) 等。如果沒有濾芯吸頭，至少應該使用新開封的吸頭。

（3）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體(ti) 。因此，最好使用全新購買(mai) 的移液槍。如果沒有新購買(mai) 的移液槍，至少應該使用以前沒有進行過細胞培養(yang) 的移液槍。因為(wei) 進行過細胞培養(yang) 的移液槍極有可能被含支原體(ti) 的培養(yang) 液汙染（如細胞培養(yang) 時，不小心將含支原體(ti) 汙染的培養(yang) 液吸入移液槍的槍體(ti) 內(nei) ）。移液槍中吸附的支原體(ti) 有可能造成不必要的假陽性。

（4）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照、待測樣品的吸頭，務必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內(nei) ，全部樣品吸取完後，蓋上瓶蓋，以防止陽性的揮發，造成環境的汙染，進而造成假陽性。

（5）整個(ge) 操作過程，最好不要說話，因為(wei) 人的口腔和唾液都是帶支原體(ti) 的。

（6）反應後，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的汙染。結果判斷完後，將其用自封袋密閉，扔到另外一個(ge) 房間的垃圾桶內(nei) 。

4. 本試劑盒的檢測準確率：（1）由於(yu) 本試劑盒能識別的支原體(ti) 大概隻占了汙染細胞的支原體(ti) 的99%左右，還有1%左右的汙染細胞的支原體(ti) 有可能不認識，這可能會(hui) 導致1%左右的假陰性（漏檢）。（2）由於(yu) 人體(ti) 的口腔、皮膚和尿道都是含有支原體(ti) 的，而且常用的腫瘤細胞係支原體(ti) 汙染率非常高，一般在15-90%之間，導致實驗室環境甚至移液槍也經常含有支原體(ti) ，這可能導致出現極個(ge) 別的假陽性（多檢，正常這種概率應該低於(yu) 1%）。總體(ti) 來說，單獨使用本試劑盒有可能出現1-2%左右的錯誤率（注意：細胞培養(yang) 中支原體(ti) 出現的概率是來自文獻數據，是大量體(ti) 外細胞培養(yang) 支原體(ti) 汙染調查的結果。如果你們(men) 實驗室細胞汙染的恰巧是出現概率比較低而本試劑盒又不認識的支原體(ti) ，漏檢的概率會(hui) 大幅度上升。因此：對所有重要的樣品（比如，可能用於(yu) 人體(ti) 的細胞），不能隻依靠本試劑盒就下最終檢測結論，必須至少同時使用另外一種支原體(ti) 識別率為(wei) 100%的支原體(ti) 檢測試劑盒【比如本公司《PCR法支原體(ti) 檢測試劑盒》或《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》】進行檢測，互相驗證！）。為(wei) 了提高檢測的準確率，建議客戶采取以下兩(liang) 種措施：第一，對所有本試劑盒檢測出的陽性樣品，利用本試劑盒或者其他不同原理的支原體(ti) 檢測試劑盒進行複檢（複檢可以基本排除因環境汙染導致的假陽性），或者檢測時所有樣品直接使用兩(liang) 個(ge) 反應管同時檢測檢測，隻有同一個(ge) 樣品兩(liang) 個(ge) 反應管的檢測結果都為(wei) 陽性時，才能判斷為(wei) 真正的陽性樣品。第二，對所有重要的樣品（比如，可能用於(yu) 人體(ti) 的細胞），必須至少同時使用兩(liang) 種（甚至三種）不同原理的支原體(ti) 檢測試劑盒（其中一種方法推薦使用支原體(ti) 識別率為(wei) 100%的《PCR法支原體(ti) 檢測試劑盒》或《探針法支原體(ti) 檢測試劑盒》）進行檢測，互相驗證。

5. 如發現細胞被支原體(ti) 汙染，本公司提供細胞專(zhuan) 用支原體(ti) 清除和預防試劑，以及水浴專(zhuan) 用殺菌劑和環境專(zhuan) 用殺菌劑。

6. 支原體(ti) 檢測樣品可以分成兩(liang) 類：第一類，用含血清的培養(yang) 液培養(yang) 的哺乳動物細胞上清液，由於(yu) 該條件非常適合支原體(ti) 生長，培養(yang) 數天後，支原體(ti) 密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yang) 液等樣品，由於(yu) 這些樣品即使有支原體(ti) 汙染，支原體(ti) 含量一般很少，直接使用快速支原體(ti) 檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體(ti) 進行離心濃縮或者使用本公司《支原體(ti) 基因組提取試劑盒》將支原體(ti) 濃縮提取，該兩(liang) 種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如後麵的培養(yang) 法。（2）使用支原體(ti) 液體(ti) 培養(yang) 基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩(liang) 種支原體(ti) 液體(ti) 培養(yang) 基）培養(yang) 3-7天後，再進行檢測。具體(ti) 方法請參考本公司《發光法支原體(ti) 檢測試劑盒》說明書(shu) 中最後的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。

7. 如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體(ti) 含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yang) 液、生物製品、極個(ge) 別細胞培養(yang) 上清等），可以采取以下幾種措施：（1）通過使用本公司《支原體(ti) 基因組提取試劑盒》，將支原體(ti) 濃縮提取後再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑製劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體(ti) 進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉澱，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心後（1000 g，5 seconds），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍。

運輸及保存方法

        該產(chan) 品隨冰袋運輸，收到產(chan) 品後請立即放-20 ℃冰箱保存，該條件下，至少3年內(nei) 仍然有活性。

產(chan) 品用途

   《一步恒溫法支原體(ti) 檢測試劑盒》（One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit）主要用於(yu) 檢測細胞培養(yang) 液或別的液體(ti) 樣品中是否含有支原體(ti) 。本產(chan) 品僅(jin) 供科研使用。