F1010用戶手冊：肽核酸（PNA）端粒探針熒光原位雜交（FISH）實驗方案

肽核酸（PNA）端粒探針熒光原位雜交（FISH）實驗方案

原理上，熒光原位雜交（FISH）技術應能提供單個(ge) 染色體(ti) 的端粒長度信息。直接標記的寡核苷酸探針因其尺寸小（穿透性好）、單鏈性質（無需探針變性）及可控製合成等特點，成為(wei) 此類分析中有吸引力的探針。

然而，針對端粒重複序列的寡核苷酸雜交效率有限，該方法僅(jin) 能用於(yu) 不同物種染色體(ti) 中TTAGGG重複序列的定性研究。近期研究表明，肽核酸（PNA）寡核苷酸探針可與(yu) 互補寡核苷酸序列雜交，且形成的雙鏈穩定性高於(yu) /或/RNA雙鏈。

在PNA中，傳(chuan) 統和RNA寡核苷酸的帶電磷酸-（脫氧）核糖骨架被由重複的N-（2-氨基乙基）-甘氨酸單元通過肽鍵連接而成的不帶電骨架所取代。與(yu) 寡核苷酸相比，PNA寡聚體(ti) 具有更高的序列特異性、更好的穩定性、可重複性以及更低的背景信號。由於(yu) PNA/雙鏈的解鏈溫度（Tm）更高，短鏈（18聚體(ti) ）端粒PNA探針（CCCTAA）₃被廣泛應用。

實驗前準備

一、端粒PNA探針製備

1.  打開試管前先離心，使凍幹的PNA探針聚集在試管底部。

2.  向試管中加入甲酰胺，配製PNA探針儲(chu) 備液。

3.  用PNA雜交緩衝(chong) 液稀釋儲(chu) 備液，使終濃度達到200nM。

✓ 注意：探針溶液需避光，4℃儲(chu) 存。

二、溶液製備

1.  雜交緩衝(chong) 液

20mM 磷酸氫二鈉（Na₂HPO₄），pH 7.4

20mM 三羥甲基氨基甲烷（Tris），pH 7.4

60% 甲酰胺

2×標準檸檬酸鹽溶液（SSC）

0.1μg/ml 鮭魚精

2.  核糖核酸酶A（RNase A）溶液

在2×SSC中加入RNase A，終濃度為(wei) 100μg/ml

3.  0.005%胃蛋白酶溶液

取50μl 5%胃蛋白酶儲(chu) 備液，加入50ml 0.01M鹽酸（HCl）中稀釋。

✓ 注意：現配現用！使用前預熱至45℃。

4.  洗滌液

2×SSC/0.1%吐溫-20（Tween-20）

雜交與(yu) 洗滌步驟

一、預處理

1.  按照特定細胞係的推薦流程製備玻片，自然晾幹。

2.  將玻片浸入磷酸鹽緩衝(chong) 液（PBS）中，孵育15分鍾。

3.  用含4%多聚甲醛的PBS溶液在37℃下固定玻片4分鍾。

4.  加入500μl RNase A溶液，37℃孵育1小時。

5.  向潔淨培養(yang) 皿中加入500μl RNase A溶液，將每張玻片的樣本麵朝下置於(yu) 溶液上，37℃孵育1小時。

✓ 注意：避免玻片幹燥。

6.  用2×SSC洗滌（重複3次），再用去離子水（DW）洗滌。

7.  將玻片浸入0.005%胃蛋白酶溶液中，37℃孵育4分鍾。

8.  用PBS在37℃下洗滌3分鍾（重複2次）。

9.  重複步驟3-4。

10. 在室溫下用PBS洗滌5分鍾。

11. 用梯度冷乙醇脫水（70%、85%、100%乙醇各浸泡1分鍾）。

12. 自然晾幹玻片。

二、雜交

1.  將玻片放入預熱至80℃的培養(yang) 箱中，孵育5分鍾。

2.  向每張玻片的標記區域加入20μl含PNA探針的雜交緩衝(chong) 液。

✓ 注意：雜交緩衝(chong) 液使用前需在90℃加熱5分鍾。

3.  用18×18mm蓋玻片覆蓋玻片的標記區域。

✓ 注意：避免玻片幹燥。

4.  將玻片在85℃下變性10分鍾。

✓ 注意：變性溫度需控製在80℃-90℃之間。

仔細檢查培養(yang) 箱溫度。

變性溫度低於(yu) 75℃會(hui) 嚴(yan) 重影響實驗結果。

5.  將玻片置於(yu) 避光環境中，室溫孵育1小時。

三、洗滌

1.  將玻片浸入室溫下的洗滌液中，移除蓋玻片。

2.  在55-60℃下用洗滌液洗滌玻片10分鍾（重複2次）。

✓ 注意：洗滌溫度需嚴(yan) 格控製在55-60℃。

3.  在室溫下用洗滌液洗滌玻片1分鍾。

四、複染

1.  將玻片浸入DAPI/2×SSC溶液中，染色10分鍾。

2.  用2×SSC洗滌玻片2分鍾。

3.  用1×SSC洗滌玻片2分鍾。

4.  用去離子水（DW）洗滌玻片2分鍾。

5.  離心幹燥玻片。

6.  在玻片的目標區域滴加一滴封片液。

7.  蓋上蓋玻片，使封片液在蓋玻片下均勻擴散，避免產(chan) 生氣泡。

8.  使用配備相應濾光片的熒光顯微鏡觀察染色後的玻片。

參考文獻

1. Kentaro Taemura 等，2005年，《發育生物學》（Developmental Biology），第281卷，196-207頁。

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5. M. Hultdin 等，1998年，《核酸研究》（Nucleic Acids Research），第26卷（16期），3651-3656頁。

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