Phusion高保真聚合酶中的戰鬥機

 如果PCR產(chan) 物需要進行後繼的克隆表達研究，需要進行高保真度PCR以減少PCR過程中出錯而造成的點突變，我們(men) 通常會(hui) 選擇高保真聚合酶。一般的高保真聚合酶因為(wei) 本身的校驗功能注定了效率低，產(chan) 量低，條帶弱，時間慢。的高保真酶Pfu的效率大概隻有韦德唯一官方酶的1//5。常有人感歎“又貴又不好用（指產(chan) 量低）”！為(wei) 了提率，有些公司又推出了混合酶，將韦德唯一官方與(yu) 帶校驗功能的聚合酶混合，中庸的結果就是效率不如韦德唯一官方酶，保真度不如Pfu，一般就比韦德唯一官方高3倍，價(jia) 格還不便宜。

Finnzymes公司獨辟蹊徑，將雙鏈結合蛋白（紫色）與(yu) 一種新型的具有校對功能的類熱球菌酶（綠色）融合，形成了一種*的高性能聚合酶——Phusion® 聚合酶。這下，兩(liang) 個(ge) 問題都解決(jue) 了。

 
圖1. Phusion 聚合酶的*結構

快人一步

由於(yu) 這項*的融合技術，Phusion 聚合酶合成的速度和準確度是以往任何單一酶都難以企及，即使是zui複雜的模板，也能準確、快速地完成反應。與(yu) 其他酶相比，Phusion 聚合酶在每次與(yu) 的結合反應中都能夠摻入更多的核苷酸，其高處理能力大大縮短了延伸步驟的時間，進而加快了整個(ge) 反應的進行。它的延伸速度是Pfu酶的10倍，比韦德唯一官方酶還要快一倍，達到15-30秒/kb。如果你還想更快，可以選擇Phusion® Flash快速高保真聚合酶，每kb 堿基的延伸時間僅(jin) 為(wei) 15 秒或更少，反應時間zui短，酶的用量顯著低於(yu) 其他常見的聚合酶。Phusion 聚合酶的高速度和率使得它能在zui短時間內(nei) 獲得大量產(chan) 物。

Finnzymes曾做過實驗，從(cong) Thermus sp.基因組文庫中隨機挑選16個(ge) 克隆，並用3種不同的耐熱聚合酶進行擴增。結果顯示，Phusion® 聚合酶具有強勁的性能和速度，它能夠成功擴增出隨機挑選的16個(ge) 片段中的15個(ge) （94%），並且產(chan) 量很高。而Pfu 聚合酶的成功率僅(jin) 為(wei) 56%，韦德唯一官方 聚合酶成功率也才62%，二者的產(chan) 量明顯低於(yu) Phusion® 聚合酶。而且從(cong) 圖中可以看出，Phusion® 聚合酶的延伸時間和酶用量均顯著低於(yu) Pfu酶，與(yu) 韦德唯一官方相當，但產(chan) 量更高。如此強勁的性能，無出其右。

 
圖2. Phusion 聚合酶集超高保真度、快速和強勁的性能於(yu) 一體(ti)

節約時間，節約用量

由於(yu) 其結構*，Phusion 聚合酶的效率非常高。在PCR反應中，該酶的用量顯著低於(yu) 其他常見的聚合酶。研究人員曾使用3種不同的聚合酶擴增一個(ge) 長為(wei) 3.8kb的人β球蛋白基因。使用Phusion 聚合酶不但可成功擴增出此3.8kb的基因組片段，且退火和延長步驟僅(jin) 需1分鍾，明顯快於(yu) 其他兩(liang) 種聚合酶。一個(ge) 單位的Phusion 聚合酶所獲得的產(chan) 物高於(yu) 5個(ge) 單位的Pfu 聚合酶的產(chan) 量，比2.5個(ge) 單位改良的Pfu的產(chan) 量也高得多。

圖3. 用更少的酶 —— 獲得更多的產(chan) 物

適用性強

此外，Phusion 聚合酶能夠zui大限度地容忍各種PCR抑製劑，因此隻需要很少的優(you) 化步驟就可以進行非常的擴增。這個(ge) 特點也催生了的直接PCR。對於(yu) 血液、組織等多種樣品，甚至是FFPE樣品，無需提取，即可直接開展高保真PCR擴增。

Phusion 聚合酶有多個(ge) 版本可供選擇。 除了上麵提到的Phusion Flash，還有Phusion熱啟動II高保真聚合酶，其高度特異性和*聚合能力決(jue) 定了它是熱啟動PCR的理想選擇。幾種酶的特點和產(chan) 品形式如下：

價(jia) 格便宜 選擇多樣

Phusion 聚合酶性能如此強勁，而價(jia) 格卻相當親(qin) 民。以Phusion高保真PCR 試劑盒（含除模板引物外其他所需試劑）為(wei) 例，目錄價(jia) 隻需555元即可進行125次反應（每次20μl ），單次反應成本才4.44元，1878 元即可有500次反應，簡直太給力了！
Phusion 聚合酶（含酶，緩衝(chong) 液，Mg離子，DMSO）隻要879元/100U，足夠做100次50ul反應。要知道PfuUltra目錄價(jia) 100U的單酶（40次反應）也不止1900啊！

Phusion 聚合酶還提供其他多種選擇，熱啟動的高保真單酶（1067元/100U），還有針對GC含量豐(feng) 富模板，或者特別含HF緩衝(chong) 液的預混合酶MasterMix係列產(chan) 品。

更少出錯

更重要的是，Phusion 聚合酶是目前市場上保真度zui高的熱穩定性聚合酶。使用改良的lacI方法檢測，Phusion 聚合酶的錯配率比韦德唯一官方 聚合酶低約50倍, 比Pfu 聚合酶低6倍，是高保真PCR的理想選擇。對於(yu) 研究基因功能，需要從(cong) 事定點突變，基因克隆和表達分析等工作來說，Phusion 聚合酶無疑是更好的選擇。

韦德唯一官方酶出錯幾率較高，且平均擴增長度不超過3.5kb。而Phusion 聚合酶則可擴增10kb以上（<20kb）的超長片段，保真度高不容易出錯，再加上擴增速度比普通高保真酶快得多，故使用Phusion 聚合酶可以有效節約很多時間。