Cytoskeleton，Inc。很高興(xing) 為(wei) 藥物篩選，信號轉導和細胞骨架研究提供廣泛的試劑盒和產(chan) 品。我們(men) 專(zhuan) 注於(yu) 生產(chan) 純化蛋白質和易於(yu) 使用的試劑盒，以研究生物化學和細胞過程。我們(men) 的試劑盒可用於(yu) 少量樣品，用於(yu) 基礎研究或小屏幕（Biochem Kits™），也可用於(yu) 大屏幕的高通量樣品（CytoDYNAMIX Screens™）。

除了我們(men) 現有的產(chan) 品，我們(men) 還在產(chan) 品線中為(wei) 微管，微管蛋白，運動蛋白，小G蛋白效應物，GAP，GEF和其他幾種蛋白提供藥物篩選服務。

Cytoskeleton的Biochem Kits™是用於(yu) 分析細胞骨架生物化學和信號轉導的不同方麵的綜合試劑盒。這些工具包通常構成出版物中圖形的基礎，請查看引文標簽中的示例。該試劑盒附帶了分析所需的所有試劑以及如何使用它們(men) 的詳細說明，因此您可以在準備好試劑盒後立即進行分析！

· 測量蛋白質和藥物對肌動蛋白聚合/解聚的影響。

· 發現和表征肌動蛋白結合蛋白（ABPs）。

· 在細胞或組織裂解物中定量G-肌動蛋白（單體(ti) ）對F-肌動蛋白（聚合物）。

· 將設置時間從(cong) 幾個(ge) 月縮短到幾天。

許多出版物引用了在論文的材料和方法部分中使用Cytoskeleton的試劑盒。通常，引文與(yu) 圖形或圖像形式的特定結果相關(guan) 聯，這有助於(yu) 您，作者，您的發現。這表明套件可在短時間內(nei) 生成出版物質量數據，從(cong) 而有助於(yu) 提高工作效率。肌動蛋白試劑盒的引用示例如下所示。個(ge) 別產(chan) 品頁麵上提供了更多引文。

問題1：哪種試劑盒是檢測肌動蛋白結合蛋白的*選擇？ 

答案1：  Cytoskeleton有兩(liang) 個(ge) 肌動蛋白結合蛋白旋轉分析試劑盒，是識別和表征肌動蛋白結合蛋白的理想選擇。一個(ge) 試劑盒使用肌肉肌動蛋白（Cat。＃BK001），另一個(ge) 試劑盒使用非肌肉肌動蛋白（Cat。＃BK013）。兩(liang) 種測定均利用共沉澱來鑒定蛋白質是否與(yu) 單體(ti) 或絲(si) 狀肌動蛋白結合以及蛋白質是否具有F-肌動蛋白切斷或成束特性。為(wei) 了檢查與(yu) 肌動蛋白單體(ti) 結合的化合物或蛋白質，含有鏈黴抗生物素蛋白包被的孔的96孔板可以與(yu) 生物素化肌動蛋白複合（Cat。＃AB07）產(chan) 生肌動蛋白單體(ti) 捕獲蛋白。然後可以將化合物，蛋白質或提取物與(yu) 捕獲蛋白一起溫育，並且可以通過HRP檢測係統使用針對目標化合物或蛋白質的抗體(ti) （或標記可以與(yu) 測試蛋白綴合）來顯現結合。請記住，緩衝(chong) 液組成也很重要，因為(wei) 它需要低鹽（約50 mM）並含有CaCl 2（或其他二價(jia) 陽離子）和ATP以維持肌動蛋白單體(ti) 的穩定性。有關(guan) 兼容緩衝(chong) 液的示例，請參閱我們(men) 的一般肌動蛋白緩衝(chong) 液配方（Cat。＃BSA01-001）。或者，可以用GST標記感興(xing) 趣的蛋白質（避免還原劑）並與(yu) 板綴合，然後與(yu) 生物素化的肌動蛋白一起溫育，並用HRP綴合的鏈黴抗生物素蛋白顯現。

問題2：當我對感興(xing) 趣的肌動蛋白沒有可用的芘結合物（例如心髒，平滑肌或細胞質肌動蛋白）時，如何用芘測定法測量肌動蛋白聚合？ 

答案2：  為(wei) 了檢查未標記肌動蛋白的聚合，請點擊此處查看使用過量未標記肌動蛋白（心肌，平滑肌或細胞質）加10％芘標記肌肉肌動蛋白的聚合方案。芘肌肉肌動蛋白不會(hui) 以該測定中使用的濃度自身聚合，因此反應依賴於(yu) 未標記的非肌肉肌動蛋白形成F-肌動蛋白。以這種方式，芘標記的肌肉肌動蛋白被吸收並聚合以充當用於(yu) 聚合未標記的肌動蛋白的報道分子，其以更高的濃度存在。

問題3：如何從(cong) 細胞或組織提取物中測量G-和F-肌動蛋白？ 

答案3：  確定細胞或組織樣本中遊離球狀肌動蛋白（G-肌動蛋白）含量與(yu) 絲(si) 狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）含量的可重複和準確的方法是使用F-肌動蛋白和G-肌動蛋白部分的Western印跡定量。 。一般方法是使F-肌動蛋白穩定緩衝(chong) 液中的細胞或組織均質化，然後高速離心以將F-肌動蛋白與(yu) G-肌動蛋白池分離。然後通過SDS-PAGE分離級分，並通過Western印跡定量肌動蛋白。終結果給出了準確的方法來確定摻入細胞骨架的F-肌動蛋白與(yu) 細胞質中發現的G-肌動蛋白的比例。細胞骨架提供了一種簡單易用的選擇，可用G-肌動蛋白/ F-肌動蛋白體(ti) 內(nei) 檢測試劑盒（Cat。＃BK037）定量G-和F-肌動蛋白。該試劑盒提供了在不同處理條件下定量細胞或組織樣品中單體(ti) 和聚合肌動蛋白水平的所有必需試劑。將樣品離心，然後將沉澱（F-肌動蛋白）和上清液（G-肌動蛋白）溶解於(yu) SDS上樣緩衝(chong) 液中並通過Western印跡處理。 

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肌動蛋白結合蛋白旋轉分析Biochem試劑盒：人血小板肌動蛋白

窗體(ti) 頂端

30-100次分析（Cat。＃BK013）

窗體(ti) 底端

產(chan) 品用途包括

· 確定蛋白質是否與(yu) 肌動蛋白的細絲(si) 或單體(ti) 結合。

· 確定蛋白質是否捆綁F-肌動蛋白

· 測試與(yu) 肌動蛋白結合的各種條件（例如適pH）或要求（例如二價(jia) 陽離子要求）

簡介
肌動蛋白結合蛋白降速測定試劑盒提供G-或F-肌動蛋白加陽性（α - 肌動蛋白）和陰性（牛血清白蛋白，BSA）結合對照蛋白。肌動蛋白結合發生在對肌動蛋白的任何部位具有親(qin) 和力時。可以通過使用降速法測量F-肌動蛋白結合。以這種方式，離心用於(yu) 通過差異沉降將F-肌動蛋白與(yu) G-肌動蛋白分離。F-肌動蛋白結合蛋白將與(yu) 肌動蛋白絲(si) 共沉澱並在離心管底部形成沉澱。可以檢測具有F-肌動蛋白成束活性的蛋白質，因為(wei) 它們(men) 將導致F-肌動蛋白以比正常更低的離心力沉降（14,000xg對150,000xg）。F-肌動蛋白切斷蛋白，G-肌動蛋白結合蛋白或非肌動蛋白結合蛋白將留在上清液中。如果上清液中殘留的G-肌動蛋白比陰性對照樣品中的G-肌動蛋白更多，則可以預期切斷蛋白質，並且應該通過在添加測試蛋白質之前和之後測量F-肌動蛋白長度分布來進一步測試該活性。G-肌動蛋白結合蛋白可以通過將測試蛋白添加到G-肌動蛋白並誘導聚合來測量，如果測試蛋白螯合G-肌動蛋白，那麽(me) 在旋轉測定期間，與(yu) 對照相比，肌動蛋白將留在上清液中。

肌動蛋白可以以兩(liang) 種形式存在：球狀亞(ya) 單位（G-肌動蛋白）和絲(si) 狀聚合物（F-肌動蛋白）（有關(guan) 更多信息，請參見關(guan) 於(yu) 肌動蛋白頁麵）。兩(liang) 種形式的肌動蛋白都與(yu) 細胞中過多的蛋白質相互作用。到目前為(wei) 止，有超過50種不同類別的肌動蛋白結合蛋白（ABP），而且庫存仍遠未完成。肌動蛋白結合蛋白允許肌動蛋白細胞骨架快速響應細胞和細胞外信號，並且在許多細胞過程中對細胞骨架參與(yu) 是*的。這些包括細胞形狀和運動，肌肉收縮，細胞內(nei) 運輸，細胞發病機理和信號轉導。

該試劑盒含有非肌肉肌動蛋白（Cat。＃APHL99）。同樣的試劑盒也可用於(yu) 骨骼肌肌動蛋白（Cat。＃AKL99），參見Cat。＃BK001。骨骼肌肌動蛋白旋轉試劑盒可能更適合用於(yu) 研究來自肌肉組織的肌動蛋白結合蛋白。

試劑盒內(nei) 容
該試劑盒包含足夠的材料，可根據檢測體(ti) 積進行30-100次檢測。包括以下試劑：

00001. 8 x250μg非肌肉肌動蛋白（Cat。＃APHL99）。

00002. α- Actinin，陽性對照（Cat。＃AT01）。

00003. BSA，陰性對照

00004. 一般肌動蛋白緩衝(chong) 液（Cat。＃BSA01）。

00005. 肌動蛋白聚合緩衝(chong) 液（Cat。＃BSA02）

00006. F-肌動蛋白緩衝(chong) 液。

00007. ATP，100 mM（Cat。＃BSA04）

00008. EGTA，0.5米

00009. 的MgCl ₂，100毫

00010. Tris-HCl pH 6.5,1.0M

00011. Tris-HCl pH 7.5,100mM

00012. 手冊(ce) 詳細的協議和廣泛的故障排除指南

需要的設備

00001. 離心設置能夠在4°C和24°C下容量為(wei) 150,000 xg，體(ti) 積容量為(wei) 50-200μl。

00002. SDS-PAGE係統。

00003. 感興(xing) 趣的蛋白質的檢測係統（考馬斯有利於(yu) 純化的蛋白質，蛋白質印跡或銀染色用於(yu) 較低純度或低豐(feng) 度的測試蛋白質）。

00004. 用於(yu) 光密度測定的凝膠掃描儀(yi) 。

問題1：當使用非肌肉肌動蛋白結合蛋白生物化學試劑盒（Cat。＃BK013或肌動蛋白結合蛋白生物化學試劑盒Cat。＃BK001）時，製備肌動蛋白結合試驗蛋白的*條件是什麽(me) ？

答案1：  在肌動蛋白相容緩衝(chong) 液（如HEPES或磷酸鹽緩衝(chong) 液）中使測試蛋白質達到盡可能高的濃度。高濃度（優(you) 選>20μM）是優(you) 化檢測肌動蛋白和測試蛋白之間相互作用的機會(hui) 所必需的。在某些情況下，K _d肌動蛋白結合蛋白/肌動蛋白相互作用的（解離常數）可以低到不能通過顆粒的蛋白質測定檢測到; 然而，對於(yu) 肌動蛋白在反應混合物中的影響可能足以通過沉澱和上清液中的肌動蛋白量與(yu) 陰性對照的差異來檢測。我們(men) 還建議將測試蛋白質在150,000 xg下在4°C下離心1小時，以去除變性蛋白質和細胞碎片。如果已經采取其他步驟（例如親(qin) 和柱純化）來純化測試蛋白，則這不是必需的。高速離心後，取出上清液置於(yu) 冰上。這是測試蛋白質原料。

總離子強度應低於(yu) 50 mM，這是由於(yu) 肌動蛋白結合的特性，因此它主要是離子的，因此會(hui) 受到中鹽和高鹽緩衝(chong) 液的影響。一個(ge) 好的起始緩衝(chong) 液是20 mM Hepes pH 7.4加20 mM KCl，加上蛋白酶抑製劑，磷酸酶抑製劑和任何必要的輔助因子。可以用20mM MgCl ₂和10mM ATP 製備低鹽肌動蛋白聚合10x緩衝(chong) 液，從(cong) 而使鹽在終反應中保持低水平。 

需要考慮的其他問題是（i）測試蛋白輔助因子可能是必需的，（ii）測定中的因子可能是主動抑製相互作用，（iii）測試蛋白可能偏愛不同類型的肌動蛋白，或（ iv）測試蛋白質在組織提取物中可以是低濃度的。

為(wei) 了解決(jue) 這些潛在問題中的一些，可以添加試劑以去除抑製劑，例如用於(yu) 鈣的EGTA（部件號BSEG-01）。在運動蛋白的情況下，ATP / Mg2 +組合將使運動與(yu) F-肌動蛋白解離，因此以1mM使用不可水解的類似物如AMPPNP。肌動蛋白親(qin) 和柱可用於(yu) 濃縮和分離更多的測試蛋白。後，不同的pH條件可以改善肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白之間的結合（例如，α-輔肌動蛋白的適pH為(wei) 7.0）。

問題2：非肌肉肌動蛋白結合蛋白生物化學試劑盒（Cat。＃BK013）可用於(yu) 測定非肌肉肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白之間的結合親(qin) 和力嗎？

答案2：   結合親(qin) 和力（K _d）可以通過旋轉降低測定來估計，通過滴定測試蛋白質濃度在0.2和20μM之間，並找到原始蛋白質在顆粒中的一半的濃度。繪製百分比測試蛋白質結合對比反應中的原始濃度以獲得以μM計的Kd。

問題3：細胞裂解液可以與(yu) 非肌肉肌動蛋白結合蛋白生物化學試劑盒（Cat。＃BK013）一起用作測試蛋白的來源嗎？

答案3：是的，細胞裂解液可用作測試蛋白的來源。然而，細胞骨架不建議這樣做，因為(wei) 蛋白質的純度和濃度通常太低而不能與(yu) 肌動蛋白相互作用。此外，裂解物將含有額外的輔助蛋白和多種磷酸酶和蛋白酶，它們(men) 可以幹擾或改變肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白之間的相互作用。如果要使用裂解物，我們(men) 建議如下：

盡管該試劑盒設計用於(yu) 純蛋白質或化合物，但一些研究人員已經添加了具有良好結果的提取物。通常研究人員使用過表達的蛋白質和類似過表達的野生型對照提取物。需要製備10mg / ml蛋白質提取物，然後將其1/3體(ti) 積用於(yu) 1mg / ml的2/3體(ti) 積的肌動蛋白。以這種方式，存在足夠高的蛋白質濃度以指示結合。提取緩衝(chong) 液應為(wei) 20mM Hepes緩衝(chong) 液pH 7.4,20mM NaCl，加上蛋白質的任何輔因子，以及蛋白酶抑製劑混合物如Cat。＃PIC02。也可加入磷酸酶抑製劑。用冰冷的緩衝(chong) 液衝(chong) 洗細胞，用注射器針頭或其他裝置彎曲25g裂解細胞。pH可以將肌動蛋白結合蛋白（ABP）的F-肌動蛋白結合特性改變0至100％。對於(yu) 提取物製備，測試pH 6.5,7.5和8.5是個(ge) 好主意。對照細胞係非常關(guan) 鍵，因為(wei) 潛在的ABP可能通過其他途徑出現在顆粒中; 例如，變性或與(yu) 其他細胞蛋白質聚集。總離子強度應保持在50 mM以下，以免使任何潛在的ABP脫鹽。

抗體

· 概述

· 常見問題解答

Cytoskeleton Inc致力於(yu) 為(wei) 肌動蛋白和肌動蛋白結合蛋白提供高質量的抗體(ti) 。我們(men) 在該係列產(chan) 品中的所有抗體(ti) 均經過QC Max™測試。已經測試QC Max TM抗體(ti) 用於(yu) 蛋白質印跡，原位和免疫沉澱。這樣，您就可以準確了解每種抗體(ti) 的用途，並確保購買(mai) 適合您的抗體(ti) 。如果您對我們(men) 的QC Max™抗體(ti) 有關(guan) 的詳細信息，請點擊下麵列出的產(chan) 品以獲取更多詳細信息。

問題1：在細胞和組織中染色F-肌動蛋白的*方法是什麽(me) ？

答案2：   細胞骨架提供我們(men) 的Acti染色係列熒光標記的鬼筆環肽，可在固定細胞和組織樣本中特異性染色F-肌動蛋白。Acti染色熒光鬼筆環肽探針非常明亮和穩定，為(wei) 標記F-肌動蛋白提供了一種非常簡單和經濟的方法。鬼筆環肽用不同的綠色和紅色熒光團（Cat。＃PHDG1，PHDR1，PHDH1和PHDN1）標記。也可以使用肌動蛋白抗體(ti) ，但通常那些也染色G-肌動蛋白，這產(chan) 生高背景。

問題2：您對多克隆抗肌動蛋白抗體(ti) 有何推薦稀釋度？

答案2：   抗體(ti) 的稀釋度取決(jue) 於(yu) 所使用的細胞/組織類型和實驗形式。對於(yu) 蛋白質印跡，我們(men) 已經測試並推薦使用濃度為(wei) 500ng / ml（1：1000稀釋）的抗體(ti) 。在該稀釋度下，我們(men) 在非洲爪蟾 A6細胞，小鼠Swiss 3T3細胞，大鼠NRK細胞，人HeLa細胞和血小板細胞的細胞提取物中檢測到肌動蛋白。對於(yu) 免疫熒光，我們(men) 使用抗肌動蛋白抗體(ti) 檢測小鼠Swiss 3T3細胞中的肌動蛋白。抗體(ti) 以2μg/ ml（1：500稀釋）的濃度使用，然後與(yu) 1：500稀釋的抗兔羅丹明綴合的第二抗體(ti) 一起溫育。這些信息通常在圖例中或我們(men) 的抗體(ti) 數據表的“產(chan) 品用途”部分中找到。

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