rokazyme生產(chan) 和銷售用於(yu) 研究，診斷和工業(ye) 測試目的的新型酶。該公司成立於(yu) 2006年，是冰島生物技術公司Prokaria的副產(chan) 品，該公司後來合並為(wei) 非營利性國有企業(ye) Matis。Prokazyme基於(yu) 二十年的地熱生物勘探，微生物基因組學和酶發現。Prokazyme（作為(wei) 中小企業(ye) ）與(yu) 馬蒂斯組成了一個(ge) 研究聯盟，並共同參與(yu) 了由歐盟資助的一些研究項目。持續的研發和與(yu) Matis的戰略聯盟使Prokazyme有機會(hui) 開發大量不斷增長的嗜熱細菌和病毒基因數據庫，並繼續開發新的*酶產(chan) 品。

ThermoPhage™ Polynucleotide Kinase – Bacteriophage RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶 - 噬菌體RM378

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一種新型的熱活性激酶，在高溫下催化的5'磷酸化，是僅(jin) 有可用的熱穩定酶。 

ThermoPhage™多核苷酸激酶是一種新型的熱活性激酶，在高溫下催化的5'磷酸化，是僅(jin) 有可用的熱穩定酶。該酶具有非常低的3'磷酸酶活性。Thermophage™多核苷酸激酶非常適合各種應用，包括核酸的放射性標記（Blondal等2005，J Biol Chem 280：5188-94）

提供500個(ge) 單位和1000個(ge) 單位（上麵選擇的產(chan) 品）以及10x反應緩衝(chong) 液。 

窗體(ti) 頂端

產(chan) 品：Pnk162S | 多核苷酸激酶500單位 | 價(jia) 格：220.00 EUR

窗體(ti) 底端

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產(chan) 品：Pnk162L | 多核苷酸激酶1000單位 | 價(jia) 格：320.00 EUR

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有關(guan) 詳細信息，請參閱下文或下載產(chan) 品說明書(shu)

介紹：

ThermoPhageTM多核苷酸激酶（PNK）催化磷酸（Pi）從(cong) ATP的γ-位置轉移到羥基化核酸（RNA或，單鏈或雙鏈）的5'末端或將Pi交換為(wei) 單體(ti) 。 - 磷酸化核酸（1）。ThermoPhageTM PNK來源於(yu) 感染Rhodothermus marinus的噬菌體(ti) RM378（2）。從(cong) 大腸杆菌中表達並純化重組PNK蛋白。ThermoPhageTM PNK的適溫度為(wei) 60-70°C。對於(yu) 短的孵育時間（1小時或更短），酶的適溫度約為(wei) 70°C，但對於(yu) 更長的孵育方案，我們(men) 建議60-65°C。ThermoPhage PNK具有Mn2 +依賴性3'磷酸水解酶活性，不會(hui) 幹擾其5'激酶活性。

應用：

• 使用32P-γ-ATP標記核酸用於探針和測序。

• 核酸的磷酸化用於隨後的克隆連接。

• 用於連接酶反應的寡核苷酸的磷酸化，如連接酶鏈反應和類似程序（3-4）。

• 用修飾的磷酸（即硫醇 - 磷酸）對核酸進行磷酸化，用於隨後的修飾和/或標記。

注意：   ThermoPhage PNK受高濃度（> 50 mM）鹽濃度（KCl和NaCl）的抑製，並受到磷酸根離子和銨離子的強烈抑製。標記5'磷酸化核酸（交換反應）將在與(yu) 正向反應相同的緩衝(chong) 液中起作用，但需要更多的時間和酶。如果使用包括RNA和RNA酶抑製劑在內(nei) 的方案，請確保它們(men) 在高溫下有活性，例如SUPERase InTM（Ambion）或RNAse-Free核糖核酸酶抑製劑（CHIMERx）。

儲(chu) 存：
儲(chu) 存和稀釋緩衝(chong) 液：10mM Tris（pH 8），50mM KCl，0.1mM EDTA，0.1μMATP，1mM DTT和50％甘油。ThermoPhageTM PNK在-25至-15°C下儲(chu) 存可穩定一年。

單位定義(yi) 的反應條件：
1x反應緩衝(chong) 液（50mM MOPS（pH 8.5），1mM DTT，10mM MgCl 2,10mM KCl），2nmol ATP，25μg/ ml BSA，5％PEG6000,1nmol ss寡核苷酸和ThermoPhageTM PNK酶在20μl體(ti) 積中於(yu) 70℃溫育15分鍾。

濃度和單位定義(yi) ：
濃度25U /μl 
一個(ge) 單位的ThermoPhageTM多核苷酸激酶催化在70℃下在30分鍾內(nei) 將1nmol的γ-磷酸從(cong) ATP轉移到寡核苷酸的5'羥基化末端（5）。

應用協議：

反應方案：
對於(yu) 優(you) 化的磷酸化反應方案，在25-50μl反應體(ti) 積中使用10-20單位的酶與(yu) 1x反應緩衝(chong) 液，5％PEG6000,25μg/ ml BSA，10-100μMATP和底物。在60-70°C孵育1-2小時。
對於(yu) 使用32P的標記反應，33P-γ標記的ATP使用10pmol標記的ATP，至少10pmol底物和10單位PNK，如上所述在其標準緩衝(chong) 液中。在60-70°C孵育1-2小時。
如果進行交換5'激酶反應，則增加孵育時間和/或使用的酶量。

活性測定：
1x ThermoPhageTM PNK緩衝(chong) 液，25μg/ ml BSA，2nmol ATP（ATP和32P-γ-ATP的混合物）和1nmol ss 5'羥基化寡核苷酸寡聚物底物和20μl反應體(ti) 積中的0.1-0.5單位PNK。在70℃溫育15分鍾後，通過在95℃加熱5分鍾終止反應，並將樣品在DE81濾器上捕獲並在250mM磷酸鹽緩衝(chong) 液中洗滌兩(liang) 次。然後將過濾器幹燥並在液體(ti) 閃爍計數器中計數放射性並測定磷酸鹽的摻入。

特征：

溫度穩定性：
ThermoPhageTM多核苷酸激酶在60°C時穩定，但在65-70°C的延長時間內(nei) 開始失活。標準測定在50,60,65和70℃下進行，並且在0,30,60和120分鍾時取樣（圖1）。

圖1：在50-70℃下隨時間的熱穩定性。該酶在50-60℃下穩定，但在65-70℃的延長時間內(nei) 開始鬆散活性。

溫度宜：
ThermoPhage™多核苷酸激酶的適溫度在60°C至70°C之間。我們(men) 建議70°C的孵育時間短（1小時）。如果孵育時間較長，我們(men) 建議在60°C溫育。然而，如圖2所示，對於(yu) 更短的孵育時間，酶在高達90°C時顯示出相對較高的活性。

圖2：在標準測定條件下在給定溫度下孵育1小時的ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性。

5'激酶活性：
在標準條件下用10μMATP（32P-γ-和未標記的ATP的混合物）和20μMdA20或rA20寡聚體(ti) 和5％PEG6000測定ThermoPhage多核苷酸激酶。反應時間在70℃下在10μl反應體(ti) 積中30分鍾。加入終止溶液（95％甲酰胺20mM EDTA，0.05％溴酚藍和0.05％二甲苯Cyanol FF）終止反應。樣品在20％UREA-PAGE凝膠上電泳，幹燥並放射自顯影。

圖3：標準條件下ss（dA20）和RNA（rA20）的磷酸化。PAGE凝膠顯示使用5單位ThermoPhage PNK酶在標記反應中*耗盡ATP。

3'磷酸水解酶活性：
ThermoPhageTM PNK在pH5-7時具有宜的3'磷酸水解酶活性，主要存在於(yu) Mn2 +中，如圖4所示。主要底物是2'-3'cAMP，如圖5所示。水解酶活性不應幹擾ThermoPhageTM PNK的5'激酶反應。

圖4： 2'-3'cAMP上ThermoPhageTM PNK 3'磷酸水解酶活性的pH曲線。

圖5： ThermoPhage PNK和T4 PNK在100μM2'-3'cAMP，3'TMP和dA15-PO4-底物上的3'磷酸水解酶活性的比較。

質量控製：
如下所述測定每批ThermoPhageTM多核苷酸激酶的活性和汙染活性。

缺乏核酸內(nei) 切酶：

• 將0.25μg超螺旋pBR322 與增加量的ThermoPhageTM PNK在25μl反應中於37℃和64℃溫育4小時。100U的ThermoPhageTM PNK顯示pBR322 的超螺旋結構沒有鬆弛。

• 將0.25μgλ- Eco RI / HindIII片段與ThermoPhageTM PNK在25μl反應中於37℃和64℃溫育4小時。100U的ThermoPhageTM PNK顯示沒有改變條帶圖案。

不含核酸外切酶：將
增加量的ThermoPhageTM PNK在含有[3H] - 標記的的50μl測試緩衝(chong) 液中於(yu) 37℃和64℃溫育4小時。顯示無外切核酸酶活性的酶量至少為(wei) 200單位。

缺乏Rnases：
來自Ambion的RNaseAlertTM實驗室測試試劑盒（目錄號1964）用於(yu) 根據製造商的方案檢測RNase活性。在100單位ThermoPhageTM PNK孵育1小時後未檢測到RNase活性。

參考文獻：

• Sambrook，J.，Fritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY。

• Hjörleifsdottir，S。等。（2002）嗜熱宿主生物的噬菌體RM 378 - 美國專li號6,492,161
•  

Blondal等人。（2005）來自噬菌體(ti) RM378的5'-多核苷酸激酶/ 3'-磷酸酶的表征-J Biol Chem 280：5188-94。

• Wu，DY＆Wallace，RB（1989）Genomics 4,560-569。

• Barringer，K。，et al。（1990）Gene 89,117-122。

• Richardson，CC（1965）Proc Natl Acad Sci USA 54,158-165。

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