rokazyme生產(chan) 和銷售用於(yu) 研究，診斷和工業(ye) 測試目的的新型酶。該公司成立於(yu) 2006年，是冰島生物技術公司Prokaria的副產(chan) 品，該公司後來合並為(wei) 非營利性國有企業(ye) Matis。Prokazyme基於(yu) 二十年的地熱生物勘探，微生物基因組學和酶發現。Prokazyme（作為(wei) 中小企業(ye) ）與(yu) 馬蒂斯組成了一個(ge) 研究聯盟，並共同參與(yu) 了由歐盟資助的一些研究項目。持續的研發和與(yu) Matis的戰略聯盟使Prokazyme有機會(hui) 開發大量不斷增長的嗜熱細菌和病毒基因數據庫，並繼續開發新的*酶產(chan) 品。

Ice and Fire Phosporylation Kit / PNK and Alkaline phosphatase

冰和火磷酸化試劑盒/ PNK和堿性磷酸酶

Ice and Fire™磷酸化試劑盒包括用於(yu) 核酸5'末端標記的優(you) 化試劑。

Ice and Fire™磷酸化試劑盒包括用於(yu) 核酸5'末端標記的優(you) 化試劑。該新方案通過結合不耐熱蝦堿性磷酸酶（SAP）的低溫活性和熱穩定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）的高溫活性，提供簡單的“一步”處理。蝦堿性磷酸酶從(cong) 核酸的5'末端消化單磷酸，二磷酸和三磷酸，留下5'羥基。PNK催化γ磷酸從(cong) ATP轉移到核酸分子的5'-OH。在簡化的溫度控製程序中兩(liang) 種酶的組合允許磷酸化核酸的快速和有效的5'末端標記。

可作為(wei) 50個(ge) 反應的套件提供。

窗體(ti) 頂端

產(chan) 品  ：  IaF170S  | Ice and Fire kit 50反應  | 價(jia) 格：220.00 EUR

窗體(ti) 底端

有關(guan) 詳細信息，請參閱下文或下載說明書(shu)

背景：
Ice and Fire Phosphorylation試劑盒為(wei) 核酸的5'末端標記提供了優(you) 化的試劑。簡單的方案利用低溫和高溫來控製不耐熱的蝦堿性磷酸酶（SAP）和熱穩定的ThermoPhage™多核苷酸激酶（PNK）在一種溶液和優(you) 化的反應緩衝(chong) 液（專(zhuan) 項技術申請中）中的活性。該試劑盒旨在用末端單磷酸，二磷酸或三磷酸標記或RNA分子的5'末端。其他核酸如PCR產(chan) 物，寡核苷酸，限製性消化的質粒或複合物樣品RNA或也可用該試劑盒標記。基材實際上可以是任何長度。具有5'-磷酸的核酸需要在激酶反應之前去磷酸化。該試劑盒包括蝦堿性磷酸酶和熱穩定多核苷酸激酶酶混合物。這允許在較低溫度下核酸的去磷酸化，然後在加入放射性標記的[γ-32 P] ATP之前加熱滅活磷酸酶並通過新型熱穩定多核苷酸激酶（1）進行標記。SAP變性和PNK反應在70℃下進行。加熱步驟後無法檢測到SAP活性，然後進行PNK反應。具有5'-羥基（-OH）基團的核酸也可以使用該試劑盒標記。在這種情況下，磷酸酶通過加熱直接滅活，然後加入γ放射性標記的ATP並在70℃溫育。SAP變性和PNK反應在70℃下進行。加熱步驟後無法檢測到SAP活性，然後進行PNK反應。具有5'-羥基（-OH）基團的核酸也可以使用該試劑盒標記。在這種情況下，磷酸酶通過加熱直接滅活，然後加入γ放射性標記的ATP並在70℃溫育。SAP變性和PNK反應在70℃下進行。加熱步驟後無法檢測到SAP活性，然後進行PNK反應。具有5'-羥基（-OH）基團的核酸也可以使用該試劑盒標記。在這種情況下，磷酸酶通過加熱直接滅活，然後加入γ放射性標記的ATP並在70℃溫育。

優(you) 點：

磷酸化核酸的有效5'末端標記，單鏈或雙鏈

酶活性的簡單溫度控製

在反應之間不需要額外的清除步驟如苯酚/chloroform或旋轉柱，僅(jin) SAP的熱變性

單管格式，簡化程序

應用：5' - 磷酸化和RNA的終標記：

核酸酶保護測定

雜交印跡

定量PCR

產(chan) 品組件：

10X反應緩衝(chong) 液

SAP / PNK酶混合物

磷酸化的ss寡聚體(ti) （10pmol /μL）用作陽性對照

套件未隨附的組件：

放射性標記的γ-ATP [32P]

ATP

無核酸酶水

議定書(shu) ：

核酸5'放射性標記方案：冰與(yu) 火磷酸化試劑盒提供對照和優(you) 化試劑，可快速方便地標記或RNA

1）靶核酸的去磷酸化（SAP反應）：
10x SAP / PNK緩衝(chong) 液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶 / RNA 
10-100pmol無核酸酶水至
24μL在37°C孵育60分鍾

2）靶核酸的磷酸化（PNK反應）：
在37℃溫育後，將樣品加熱至70℃。在70℃下15分鍾後，向反應中加入XμL放射性標記的[γ-32 P] ATP，相當於(yu) 待標記末端的2-5摩爾過量ATP（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi / ml [γ] -32 P] ATP，1μL約為(wei) 25 pmol）。在70°C孵育另外30-60分鍾。冷卻至+ 4°C或置於(yu) 冰上以阻止反應。

任選：加入1mM EDTA和/或在95℃加熱反應5分鍾以終止反應。

任選：通過旋轉柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號28304或等效的旋轉柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來清潔探針。（2）。

放射性標記的核酸現在可以使用了

第二議定書(shu) ：

用於(yu) 5'標記5'羥基化核酸的方案：Prokazyme Ltd也提供ThermoPhage TM PNK用於(yu) 標記5'羥基化核酸，但Ice and Fire磷酸化試劑盒也可用於(yu) 此類應用。

1）反應混合物
10x SAP / PNK緩衝(chong) 液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶 / RNA 
10-100pmol無核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分鍾以滅活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'標記：
將XμL放射性標記的[γ-32 P] ATP加入到相當於(yu) 2-5摩爾過量ATP的反應中，待標記的末端（例如使用7,000 Ci / mmol，150 mCi） / ml [γ-32 P] ATP，1μL約為(wei) 25pmol）。
在70°C孵育60分鍾。冷卻至+ 4°C或置於(yu) 冰上以阻止反應。

任選：加入1mM EDTA和/或在95℃加熱反應5分鍾以終止反應。

任選：通過旋轉柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號28304或等效的旋轉柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來清潔探針。（2）。

放射性標記的核酸現在可以使用了

方案III：

沒有放射性ATP的磷酸化：該試劑盒也可用於(yu) 在克隆程序等之前磷酸化5'羥基化核酸。

1）反應混合物
10x SAP / PNK緩衝(chong) 液
2.5μLSAP/ PNK酶混合物1μL 
靶 / RNA 1-500pmol無
核酸酶水至
24μL在70℃孵育15分鍾以滅活SAP酶。

2）靶核酸的多核苷酸激酶5'磷酸化：
將ATP加入到反應中至終濃度為(wei) 10-100μM（至少兩(liang) 倍於(yu) 核酸末端的磷酸化濃度）。
在70°C孵育60分鍾。冷卻至+ 4°C或置於(yu) 冰上以阻止反應。

任選：通過旋轉柱（例如Qiagen核苷酸去除試劑盒，目錄號28304或等效的旋轉柱）或如Sambrook等所述的PAGE凝膠純化來清潔探針。（2）。

現在核酸已準備好用於(yu) 克隆程序

評估協議：

如果需要確定特定放射性或如果研究人員想要評估反應效率，則可以使用以下評估方案。請注意，此評估需要閃爍計數器，閃爍液和DE81過濾器或等效儀(yi) 器和組件。將1μL反應物稀釋至1/10並將1μL點稀釋至Whatman Inc.DE81過濾器（目錄號3658023）或其等同物。作為(wei) 陽性對照，將相同的量放在一個(ge) 不經過洗滌步驟的過濾器上。沒有酶混合物的反應溶液可用作陰性對照並用樣品洗滌。將樣品和陰性對照濾膜在400ml磷酸鈉緩衝(chong) 液pH7中洗滌兩(liang) 次30分鍾，幹燥並放入閃爍計數瓶中，加入閃爍液並在液體(ti) 閃爍計數器中計數放射性。為(wei) 了確定標記的核酸的比活性，計算摻入反應中的總cpm並將其除以pmol中標記的核酸的量。

（#total cpm合並*稀釋因子*體(ti) 積）/（#total pmol核酸）

預期的比活性：
當具有7000 Ci / mmol的比活性的[γ-32P] ATP用於(yu) 激酶反應時，核酸應在參考日期標記至至少1×10 6 cpm / pmol。在放射性標記的ATP小瓶上標明的參考日32P的衰變可以計算為(wei) :(原始cpm /μl）/（2（天/ 14.3））

參考文獻：

Blondal，T.，Hjorleifsdottir，S.，Aevarsson，A.，Fridjonsson，OH，Skirnisdottir，S.，Wheat，JO，Hermannsdottir，AG，Hreggvidsson，GO，Smith，AV and Kristjansson，JK（2005）J Biol Chem， 280,5188-5194。

Sambrook，J.，Fritsch，EF和T.，M。（1989）Molecular cloning，a laboratory manual。冷泉港實驗室，紐約冷泉港。

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