Stratagene 210518說明書

agilent 210518說明書(shu)

agilent 210518即Stratagene 210518說明書(shu)

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit

Instruction Manual Catalog # 210518 (10 reactions) and #210519 (30 reactions) Revision F.0

uikchange閃電現場定向誘變試劑盒

Quikchange閃電現場定向誘變試劑盒
提供的材料

Quikchange Lightning Site定向誘變試劑盒（目錄210518）含有足夠的試劑，總共10種。
反應，包括2個(ge) 控製反應。
b Quikchange Lightning Site定向誘變試劑盒（目錄210519）含有足夠30種試劑。
反應，包括2個(ge) 控製反應。
c將dntp混合物解凍一次，製備一次性小份，並將小份儲(chu) 存在-20°C下。不要對dntp混合物進行處理。
多次凍融循環。d dntp混合物和dpn i酶的成分是專(zhuan) 有的。這些試劑已針對
quikchange-lightning協議，並已獲得與(yu) 其他套件組件一起使用的資格。不
用其他安捷倫(lun) 試劑盒或其他來源的dntp混合物或dpn i酶製劑替代。
E基因型：tetr
∆（mcra）183∆（mcrcb hsdsmr mrr）173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac hte
【F’Proab Laci】
Q
Z∆M15 tn10（太特
Amy Camr
]
f見介質和試劑的製備。
儲(chu) 存條件
XL10金超能幹細胞、XL10金β-Me和PUC18控製質粒：–80°C
所有其他部件：–20°C
所需附加材料
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管（bd biosesciences目錄）
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal）
異丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG）

買(mai) 方通知
本產(chan) 品的使用是根據以下美國專(zhuan) 有技術號57891665932419中的一個(ge) 或多個(ge) 獲得許可的，
6391548、6713285、7132265和7176004。
本產(chan) 品是根據Bio-Rad實驗室和安捷倫(lun) 技術公司之間的協議提供的。
本產(chan) 品的製造、使用、銷售或進口均以我方為(wei) 準。拍打。編號6627424和EP
拍打。Bio-Rad Laboratories，Inc.所有的1 283 875 B1號。購買(mai) 本產(chan) 品後將
買(mai) 方不可轉讓使用購買(mai) 的產(chan) 品和部件的權利。
研究領域的PCR產(chan) 品（但不是實時PCR），包括所有應用研究領域
（包括但不限於(yu) 動物試驗和食品試驗）。

介紹
Quikchange Lightning站點定向誘變套件*提供突變
質粒比我們(men) 原來的QuikChange試劑盒快三倍
誘變效率或準確性的損失。該套件已針對
高達14kb質粒的誘變，允許快速、和
用單一試劑盒誘變大小質粒。使用
先進的高保真酶技術，協議
加速，同時保持高的現場指導精度
誘變。QuikChange Lightning網站
誘變試劑盒是一種專(zhuan) 有技術的基於(yu) pfu的聚合酶混合物。
優(you) 化的dpn i酶，它們(men) 一起允許在
大約一個(ge) 小時，加上一夜之間的轉變。

圖1 Quikchange閃電現場定向誘變方法概述。

美國專(zhuan) 有技術號7176004；7132265；6734293；6444428；6391548；6183997；
5948663、5932419和5789166。
六
體(ti) 外定向誘變是一種非常有價(jia) 值的技術
描述蛋白質結構之間的動態、複雜關(guan) 係
和功能，用於(yu) 研究基因表達元件，以及執行
矢量修改。這種技術的幾種方法
但這些方法通常需要單鏈
（SS）作為(wei) 模板1–4
勞動密集型或技術難度大。
我們(men) 的QuikChange Lightning站點定向誘變套件允許站點特定
幾乎所有雙鏈質粒的突變，從(cong) 而消除
亞(ya) 克隆和SS救援的需求。5
此外，QuikChange
閃電現場定向誘變試劑盒不需要專(zhuan) 門的
載體(ti) ，*的限製位點，多重轉化或體(ti) 外
甲基化處理步驟。簡單、快速的三步程序需要
僅(jin) 在轉化前1小時（對於(yu) 小於(yu) 等於(yu) 5 kb的質粒），以及
在單一反應中產(chan) 生效率大於(yu) 85%的突變體(ti) （參見
圖1）。
Quikchange閃電酶是一種新型的專(zhuan) 有技術混合物
包括pfuultra高保真（hf）聚合酶**的衍生物
兩(liang) 條質粒鏈的誘變引物定向複製
高保真度。所有的基本程序都采用了超螺旋雙絞線。
一個(ge) 感興(xing) 趣的插入物和兩(liang) 個(ge) 合成物的（dsdna）載體(ti)
寡核苷酸引物，均含有所需的突變（見圖1）。
寡核苷酸引物，每個(ge) 引物與(yu)
載體(ti) ，在溫度循環過程中被pfuultra-hf-dna擴展。
聚合酶，無底物置換。寡核苷酸的延伸
引物產(chan) 生含有交錯缺口的突變質粒。跟隨
溫度循環，產(chan) 品經DPN I處理。
內(nei) 切酶（靶序列：5´-GM6ATC-3´）對甲基化有特異性。
半甲基化，用於(yu) 消化親(qin) 本模板
並選擇含有合成的突變。6（分離
幾乎所有的大腸杆菌菌株都是DAM甲基化的，因此對
含有所需突變的刻痕載體(ti) 。
然後轉化為(wei) XL10金超能力細胞。
注意，質粒從(cong) 幾乎所有常用的
大腸杆菌菌株（DAM+）是甲基化的，是
突變，質粒從(cong) 特殊的DAM中分離出來-
包括JM110和SCS110在內(nei) 的大腸杆菌菌株不適用。
不需要的第二位點錯誤幾乎被消除，高突變
由於(yu) 該方法的高保真度，
pfuultra-hf-dna聚合酶，使用少量起始dna
模板和使用的熱循環次數少。
QuikChange Lightning Site定向誘變試劑盒可用於(yu)
點突變，替換氨基酸，刪除或插入單個(ge) 或
多種相鄰氨基酸。該試劑盒已用質粒進行了優(you) 化。
大小從(cong) 4到14 KB不等。

* NOS的美國專(zhuan) 有技術。6734293 6444428 6183997和5948663；；；。聚合酶有HF會(hui) pfuultra 18倍比韦德唯一官方 合成的高逼真度
聚合酶。
7
控製quikchange閃電誘變
在pwhitescript 4.5-kb控製質粒是用來測試的效率
代突變質粒使用網站定向quikchange閃電
誘變試劑盒。在pwhitescript 4.5-kb質粒包含停止控製
密碼子TAA密碼子穀氨酰胺在位置（CAA）的其中一個(ge)
通常出現在β-半乳糖苷酶基因的質粒pBluescript II SK（-）
噬菌粒（9相應到氨基酸的蛋白質）。xl10金
ultracompetent細胞轉化質粒與(yu) 本控製上出現白色
lb–ampicillin瓊脂板（湖的製備和研究——媒體(ti) ）
含有IPTG和X-gal，因為(wei) β-半乳糖苷酶的活動。
obliterated。創建一個(ge) 寡核苷酸控製點突變在primers
一個(ge) reverts pwhitescript 4.5-kb控製質粒的T殘留的停止
在密碼子的氨基酸（TAA）的β-半乳糖苷酶基因的9個(ge) 殘基的C，
生產(chan) 的穀氨酰胺密碼子（CAA）發現野生型序列。
以下screened殖民地可以轉化為(wei) β-半乳糖苷酶
（β-半乳糖+）表型的媒體(ti) 上的藍色的顏色含有IPTG和X-gal染色。

底漆設計指南
本方案中使用的致突變寡核苷酸引物必須是
根據所需的突變單獨設計。以下
設計誘變引物時應考慮：
♦兩(liang) 個(ge) 誘變引物都必須包含所需的誘變和
在質粒的相反鏈上退火到相同的序列。
♦底漆的長度應在25至45個(ge) 底座之間，並熔化。
溫度（tm）≥78°C。可使用長度超過45個(ge) 堿基的底漆，
但使用較長的引物會(hui) 增加二次結構的可能性。
從(cong) 而影響誘變反應的效率。
下列公式通常用於(yu) 估算
引物：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N) − % mismatch
計算tm時：

•n是底材中的底漆長度
•%gc和%mismatch的值是整數
用於(yu) 計算用於(yu) 引入插入或
刪除，使用上述公式的修改版本：
81.5+0.41%（gc）（675/）tm=−n
其中n不包括插入或刪除的基

所需的突變（缺失或插入）應在
底漆兩(liang) 邊各有大約10-15個(ge) 正確順序的底座。
♦底漆的低GC含量應為(wei) 40%，並且
應以一個(ge) 或多個(ge) C或G基終止。
♦引物不需要5´磷酸化。
tm=81.5+0.41%（gc）−（675/n）−不匹配百分比
九
♦對於(yu) 典型的誘變引物，脫鹽純化通常是
足夠的。對於(yu) 長的或複雜的誘變引物，純化
液相色譜法（PLAC/FPLC）或聚丙烯酰胺凝膠
電泳（PAGE）可顯著增加
誘變效率。
其他底漆注意事項
♦誘變方案使用每個(ge) 寡核苷酸引物125 ng。
要將納克轉化為(wei) 低聚物的皮摩爾，請使用以下方法
方程式：

保持底漆濃度過高很重要。我們(men) 建議
改變模板量，同時保持
底漆經常過量。
 協議
突變鏈合成反應（熱循環）
注意確保質粒模板從(cong) DAM中分離出來。+
大腸杆菌菌株。大多數常用的大腸杆菌菌株
是大壩+。從(cong) DAM菌株（如JM110）分離出質粒
SCS110）不適用。
為(wei) 了大限度地提高溫度循環性能，我們(men)
建議使用薄壁管，確保理想接觸
溫度循環器的熱阻。以下協議
使用薄壁管進行優(you) 化。
1。合成兩(liang) 個(ge) 包含所需的
突變，兩(liang) 側(ce) 是未修改的核苷酸序列。淨化這些
在以下步驟中使用前的寡核苷酸引物（參見
誘變引物設計）。
2。準備控製反應如下：
5微升10×反應緩衝(chong) 液
pwHitescript 4.5-kb控製質粒5μl（25 ng）（5 ng/μl）
1.25微升（125 ng）寡核苷酸對照引物1
[34摩爾（100 ng/微升）]
1.25微升（125 ng）寡核苷酸對照引物2
[34摩爾（100 ng/微升）]
1微升dntp混合物
1.5微升液體(ti) 試劑
34微升DDH2O（使終反應體(ti) 積達到50微升）
然後添加：
1微升Quikchange閃電酶
三。製備樣品反應，如下所示：
注：使用不同數量的
dsdna模板範圍從(cong) 10到100 ng（例如，10，25，50，
和100 ng dsdna模板）同時保持引物
濃度常數。
5微升10×反應緩衝(chong) 液
dsdna模板的xμl（10–100 ng）
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）1
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）2
1微升dntp混合物
1.5微升液體(ti) 試劑
DDH2O，終體(ti) 積為(wei) 50μl

然後添加：
1微升Quikchange閃電酶
十一
4。使用表1中列出的循環參數循環每個(ge) 反應。
（對於(yu) 控製反應，延長2.5分鍾。）
表一
定向QuikChange閃電場地的循環參數
誘變方法

例如，5-kb質粒在68°C條件下每個(ge) 周期需要2.5分鍾。

DPN I放大產(chan) 物的消化
1。直接將2微升提供的DPN I限製酶添加到每個(ge)
放大反應。
注：僅(jin) 使用所提供的DPN I酶；不得用
另一種來源的酶。
2。輕輕和*地混合每個(ge) 反應混合物
上下解決(jue) 方案多次。簡單地降低反應速度
混合物，然後立即在37°C下培養(yang) 5分鍾以消化。
親(qin) 本（即非突變的）超壓縮dsdna。
XL10金超能力細胞的轉化
注意：在繼續之前，請閱讀轉換指南。
轉換協議。
XL10金細胞對四環素和
氯黴素。如果突變質粒隻含有tetr
或抗camr標記，一種有能力細胞的替代品係。
必須使用。
1。在冰上輕輕融化XL10金超能力細胞。對於(yu) 每一個(ge)
待轉化的對照反應和樣品反應，等分45微升
14 ml bd falcon聚丙烯的超能力細胞
圓底管。
2。將隨試劑盒提供的2μlβ-Me混合物添加到45μl的
細胞。（使用β-Me的替代來源可能會(hui) 減少轉化
效率。
三。輕輕地旋轉管中的內(nei) 容物。在冰上培養(yang) 細胞
2分鍾。

4。從(cong) 每個(ge) 對照品和樣品中轉移2微升經dpn i處理的。
對分離部分超能力細胞的反應。
作為(wei) 可選控製，驗證
通過添加1微升0.01 ng/微升puc18的XL10金超能力細胞
對照質粒（在水中稀釋1:10的對照品）
另一個(ge) 45-微升的小份細胞。
5。輕輕旋轉轉化反應，混合和培養(yang)
冰上反應30分鍾。
注：此步驟的培養(yang) 時間可縮短至
10分鍾，轉換過程中無重大損失
效率。
6。在A中預熱NZY+肉湯（見介質和試劑的製備）
步驟9中使用的42°C水浴。
注：XL10金超能力細胞的轉化
使用NZY+肉湯優(you) 化。
7。在42°C水浴中加熱脈衝(chong) 管30秒。持續時間
熱脈衝(chong) 對獲得率至關(guan) 重要。做
不超過42°C。
注：該熱脈衝(chong) 已優(you) 化用於(yu)
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管。
8。在冰上孵育試管2分鍾。
9。向每個(ge) 試管中加入0.5毫升預熱（42°C）NZY+肉湯，然後孵化。
管道在37°C下振動1小時，轉速為(wei) 225–250轉/分。
十三
10。將每個(ge) 轉化反應的適當體(ti) 積，如
下表所示，在含有適當
質粒載體(ti) 的抗生素。
對於(yu) 誘變和轉化控製，將細胞傳(chuan) 到
LB-氨苄西林瓊脂平板，含80μg/ml x-gal和20 mm IPTG
（參見準備用於(yu) 彩色篩選的瓊脂板）。
轉化反應電鍍量

當電鍍體(ti) 積小於(yu) 100μl時，在
瓊脂平板，用移液管將小體(ti) 積的轉化反應移入池中，然後
攤鋪混合物。
B撒布量根據
誘變質粒。通常對整個(ge) 變換混合物進行電鍍是有用的，
分為(wei) 多個(ge) 板，覆蓋一係列電鍍體(ti) 積。
11。將轉化板在37°C下培養(yang) 16小時以上。
控件轉換的預期結果
pwhitescript轉換後的預期菌落數
4.5kb對照誘變反應>100個(ge) 菌落。大於(yu) 85%
菌落應含有突變，並在瓊脂上呈藍色菌落。
含有IPTG和X-Gal的板。
注意pwitescript 4.5-kb的誘變效率（Me）
對照質粒的計算公式如下：

如果對puc18控製質粒進行轉化，
>應觀察到50個(ge) 菌落（>109 cfu/μg），其中>98%的菌落具有
藍色表型。
樣本轉換的預期結果
預期菌落數取決(jue) 於(yu) 基組分和長度。
使用的模板。關(guan) 於(yu) 增加殖民地的建議
編號，請參閱故障排除。插入感興(xing) 趣的內(nei) 容應排序為(wei)
驗證所選克隆是否包含所需的突變。

轉型指導方針
儲(chu) 存條件
超能力細胞對溫度的微小變化很敏感。
必須存放在-80°C冰箱的底部。從(cong) 傳(chuan) 輸管道
一個(ge) 冷凍室到另一個(ge) 冷凍室可能會(hui) 導致效率下降。超級電容器
電池應直接從(cong) 幹冰運輸容器放置在-80°C。
對齊單元格
配藥時，應始終將超能力細胞放在冰上。這是必要的。
把bd falcon聚丙烯管放在電池前的冰上
解凍後，細胞被直接分配到預成丘的試管中。
14毫升bd falcon聚丙烯圓底管的使用
重要的是14毫升bd falcon聚丙烯圓底管
（BD Biosesciences Catalog_）用於(yu) 轉換協議，
因為(wei) 其他試管可能會(hui) 被β-巰基乙醇降解
轉換協議。此外，熱脈衝(chong) 步驟的持續時間為(wei)
關(guan) 鍵，並針對厚度和形狀進行了專(zhuan) 門優(you) 化
這些管子。
β-巰基乙醇的使用
β-巰基乙醇（β-Me）可以增加轉化率。
效率。該試劑盒中提供的XL10金β-巰基乙醇混合物是
稀釋後即可使用。
添加的數量
當添加2μl合成物時，觀察到大效率。
反應。當添加一個(ge)
盡管總效率可能
低一些。
熱脈衝(chong) 的長度和溫度
有一個(ge) 由熱量產(chan) 生的效率高的限定窗口。
轉換過程中的脈衝(chong) 。在細胞中觀察到效率。
熱脈衝(chong) 30秒。不得超過42°C。
彩色篩選用瓊脂板的製備
準備用於(yu) 藍白篩選的LB瓊脂平板，添加80μg/ml。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal），20 mm
異丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG），以及適當的
LB瓊脂的抗生素。或者，100μl的10 mm IPTG和100μl
2%的x-gal可以在電鍍前30分鍾在LB瓊脂板上塗抹。
轉變。用無菌的DH2O製備IPTG；用
二甲基甲酰胺（DMF）。之前不要混合IPTG和X-GAL
用移液管把它們(men) 移到盤子上，因為(wei) 這些化學物質會(hui) 沉澱。

故障排除
當根據本說明手冊(ce) 中概述的指南使用時，此套件提供可靠的
使用dsdna模板進行定點突變的方法。基礎成分的變化
模板的長度和熱循環性能可能導致
誘變效率。