用於樹突和樹突棘浸染的GOLGT-COX染色係統

用於(yu) 樹突和樹突棘浸染的GOLGT-COX染色係統

                              於(yu) 體(ti) 外研究

    Bioenno Golgi Kit是一種基於(yu) 高爾基染色法設計出來的試劑盒，用於(yu) 浸染神經元樹突和樹突棘（參見下麵的參考文獻）。該試劑盒在大鼠、小鼠、貓、兔和猴子以及人類死亡後所獲得的新鮮腦組織上進行了廣泛多次的測試，確定了該試劑盒能將樹突和樹突棘穩定和高質量的染色（見圖A-C）。大多數神經元根據其組織年齡大小，用該試劑盒浸漬需要7-14天（見表2）。試劑盒儲(chu) 存在室溫（4-25ºC）下的黑暗區域。

圖中為(wei) 用Bioenno Golgi Kit侵染的樹突分支和樹突棘

（A）：低倍率（4×物鏡）顯微鏡照，顯示海馬體(ti) 中高爾基體(ti) 浸漬的神經元。

（B）：從(cong) 尾狀後肌取出的紋狀體(ti) 神經元。左側(ce) 麵板框架區域中的樹突棘（20×），在右側(ce) 圖片中放大顯示（箭頭，63×）。

（C）：從(cong) 皮質采取的錐體(ti) 神經元。 中間麵板框架區中樹突分支上的樹突棘（20×）被放大顯示在 斜（左，100×）和 主（右，100×）中。 這個(ge) 階段常觀察到類似絲(si) 狀偽(wei) 足的突起（左側(ce) 圖片的箭頭）。

參考文獻：

• Ramón-Moliner E: The Golgi-Cox technique. In Nauta WJH and Ebbesson SOE (eds.), Contemporary Methods in Neuroanatomy. pp 32–55, New York: Springer, 1970.

• Glaser ME and Van der Loos H: Analysis of thick brain sections by obverse-reverse computer microscopy: application of a new,high clarity Golgi-Nissl stain. J Neurosci Methods 1981, 4:117–125.

• Kolb B, Ladowski R, Gibb R, Gorny G. Does dendritic growth underlie recovery from neonatal occipital lesions in rats? Behav Brain Res 1996, 77:125–133.

• Gibb R and Kolb B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods 1998, 79:1–4.

保質期：套件中的物品保質期為(wei) 自購買(mai) 之日起的12個(ge) 月之內(nei) 。

退貨政策：Bioenno Tech對此產(chan) 品的退貨政策是自購買(mai) 之日起90天之內(nei) 。

免費技術支持：

隨套件提供的材料：

•溶液A：浸漬溶液（240 ml×2瓶）。溶液A是工作液，在底部看到沉澱物是正常現象，實驗隻需使用其上清液。

•試劑B：用於(yu) 製備兩(liang) 種工作緩衝(chong) 液。

緩衝(chong) 液1：浸漬後緩衝(chong) 液（30 g×5 瓶）製備方法：在90 ml dH₂O中稀釋 30g 試劑B

緩衝(chong) 液2：收集和安裝緩衝(chong) 液（30 g×5 瓶）製備方法：在500 ml dH₂O中稀釋30 g試劑B

工作緩衝(chong) 液可在4ºC下儲(chu) 存長達4周。

•溶液C：染色溶液（220 ml×2 瓶）。所提供的溶液C需在使用前用dH₂O（體(ti) 積比為(wei) 3：5）稀釋。

例如，18ml溶液C + 30ml dH₂O→48ml工作液，試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所製備的48ml工作液。 48ml工作液可用於(yu) 多達120個(ge) 切片（例如，在所提供的染色罐中總共有10個(ge) 載玻片，每個(ge) 載玻片黏附有12個(ge) 鼠腦切片）。

•試劑D：複染緩衝(chong) 液（90 g×2 瓶）。使用前需用dH₂O稀釋試劑。

在500 ml dH₂O中稀釋90 g試劑D形成工作液。工作液可在室溫下儲(chu) 存長達3個(ge) 月。

48ml工作液可用於(yu) 多達120個(ge) 切片（例如，如上所述在染色罐中的12個(ge) 切片×10個(ge) 載玻片）。

•還包含：

著色筆（大，扁平，1 隻），用於(yu) 切片轉移;

圓頭筆（小，1 個(ge) ），用於(yu) 切片安裝;

帶蓋的染色罐（2個(ge) ），用於(yu) 存儲(chu) ，染色和清洗粘連在粘性顯微鏡載玻片上的切片。

套件不提供的必要材料：

蒸餾水或去離子水（dH₂O）;

0.01M PBS-T（見表1）;

塑料或玻璃管和瓶子;

塑料鉗;

組織學用品和設備：粘合劑，顯微鏡載玻片，蓋玻片，光學顯微鏡，震動切片機或微切片機，乙醇，二甲苯或二甲苯替代品，Permount®封片劑。

表1：製備0.01M PBS-T，需先配製0.1M PB（左），然後配製含有0.3％Triton X-100的PBS（右）。

存儲(chu) 、安全和處理注意事項：

·•將試劑盒存放在室溫下。

·•試劑盒中的溶液A和C為(wei) 含劇毒試劑。 需在通風櫥中準備並使用，使用完後收集所有廢物。

•  套件A中含有用於(yu) 危險廢物處理的瓶子。

·•在處理試劑盒試劑時，需戴上手套，眼睛和麵部有適當的防護以及穿戴合適的防護服，處理後需*清洗雙手。

·•處理時避免試劑的吸入和接觸皮膚，眼睛。 如接觸，立即用水*清洗，必要時尋求醫療援助。

建議：

·•在處理溶液A和C時使用帶蓋的玻璃或塑料容器。

·•始終保持容器密閉。不要使用金屬工具來承裝溶液A。

·•使用溶液A，C或D處理大腦或切片時，避免大腦或切片受光照影響。

·•不要重複使用或稀釋工作液，在室溫下進行實驗以獲得宜效果。

1.浸漬：將剛收獲的腦組織浸入溶液A中。溶液A的體(ti) 積大約是組織塊體(ti) 積的10倍。 例如， 20ml溶液A對應成年大鼠腦（1cm×1cm×2cm）體(ti) 積。

浸泡1~2天後更換溶液，並在室溫下繼續避光浸漬（建議浸漬天數見表2）。

意見建議：為(wei) 了獲得宜侵染，建議用生理鹽水灌注動物，清除組織中的血液。 麻醉動物（例如用戊巴匕匕妥鈉，腹膜內(nei) 注射100mg / kg）。心髒內(nei) 或升主動脈用0.9％生理鹽水（例如 1000ml dH₂O中含有9g NaCl）灌注至內(nei) 髒血液量被衝(chong) 洗掉。灌注通常需要3~5分鍾。 解剖大腦並將其謹慎地從(cong) 頭骨上移除。用鋒利的刀片切割大腦至1厘米左右的厚度，在0.9％鹽水中短暫衝(chong) 洗，然後浸入溶液A.

表2：20-22℃下建議的浸漬總天數（P：出生後一天; 如：P2表示“2天齡”）

組織塊的類型和大小的不同可能影響浸漬時間，理想的時間應該通過實驗研究獲得。在大多數情況下較好的浸漬效果是在2周。如果浸漬超過2周，則可能出現非特異性染色體(ti) 。

2.浸漬後：浸漬準備好後，用蒸餾水或去離子水（dH₂O）衝(chong) 洗組織塊，然後將其轉移到套件B所製備的浸漬後緩衝(chong) 液（30 g稀釋在90 ml dH₂O）中，並在室溫下避光儲(chu) 存。 在浸泡一天後更新溶液，繼續浸泡一天。 在浸漬後2天後，將組織塊準備好切片。

組織塊可以在4°C的緩衝(chong) 液中儲(chu) 存長達1個(ge) 月

3.切片：可以使用振動切片機或類似類型的切片機將大腦切割成厚度為(wei) 100-200μm的切片。

切片應收集在套件B所製備的收集和安裝緩衝(chong) 液（30g試劑B，在500ml dH₂O中稀釋）中。

建議使用振動切片機或微切片機進行切片。如果切片機刻度範圍為(wei) 1-10，則將速度和振幅設置為(wei) 4級。 建議在分析樹枝狀分枝和樹突棘時使用100-200μm的厚度。 對於(yu) 薄切片的切割（例如50μm），需將剃刀刀片浸入二甲苯中1-2分鍾來去除刀片上的油漬。

切片過程可在溫度設定在-16°C ~ -20°C的低溫恒溫器中進行。

4.安裝：借助所提供的著色筆（大），將切片轉移到裝有收集和安裝緩衝(chong) 液的填充盤（例如95×15mm培養(yang) 皿）中。 使用圓頭筆（小），將切片安裝在粘性顯微鏡載玻片上。 1個(ge) 載玻片上可安裝6~12個(ge) 切片。

覆蓋切片：用吸水紙（例如濾紙）覆蓋濕的切片，然後通過輕壓載玻片來給吸水紙壓力，以增強切片與(yu) 載玻片的粘附。

在室溫下風幹燥切片約1分鍾。 長時間暴露在幹燥空氣中會(hui) 導致切片破碎。

將載玻片存放在幹燥且封閉的染色罐中（已提供）。 放置在封閉的染色罐中的載玻片可以在室溫下儲(chu) 存一天。一個(ge) 染色罐可以存儲(chu) 多達10個(ge) 載玻片。

5.染色：用0.01M PBS-T洗滌載玻片20~30分鍾，然後用dH₂O洗滌約1分鍾。 將載玻片置於(yu) 用dH₂O稀釋後的溶液C（體(ti) 積比 3：5）中，在封閉的染色罐中保持20±2分鍾（將罐子儲(chu) 存在黑暗區域中），然後將載玻片在dH₂O中漂洗約1分鍾。

如“試劑盒提供的材料”中所述：溶液C必須在使用前用dH₂O（體(ti) 積比為(wei) 3：5）稀釋。例如，將18ml溶液C與(yu) 30ml dH₂O混合，形成48ml工作溶液。試劑盒中提供染色罐可剛好裝下所製備的48ml工作液。48ml工作液可用於(yu) 多達120個(ge) 切片（例如，在所提供的染色罐中總共10個(ge) 載玻片，每個(ge) 載玻片黏附有12個(ge) 鼠腦切片）。

為(wei) 獲得宜效果，請勿重複使用稀釋的工作溶液。

為(wei) 了防止切片滑落，切勿在dH₂O中長時間洗滌。理想的染色時間應由實驗研究獲得。通常較好的染色效果是在20分鍾左右。

6.複染色：將載玻片置於(yu) 試劑D所製備的複染緩衝(chong) 液中，在暗處中放置20分鍾後在0.01M PBS-T中洗滌10分鍾×3次。

（可選染劑：在PBS-T洗滌後，切片可用甲酚紫、甲基綠或其他合適的染色試劑複染。）

用dH₂O衝(chong) 洗載玻片約1分鍾，然後風幹。當切片不*幹燥（通常需要5~10分鍾）時，將載玻片存放在幹燥且封閉的染色罐中，或繼續下一步操作“清潔和覆蓋”。

載玻片可以在室溫條件下儲(chu) 存在罐中一天。

為(wei) 了防止長時間暴露在幹燥空氣導致切片的碎片化，需將載玻片存放在幹燥且封閉的染色罐中。

48ml複染緩衝(chong) 液可用於(yu) 多達120個(ge) 切片（例如，如“5.染色”中所述，在染色罐中的12個(ge) 切片×10個(ge) 切片）。 為(wei) 獲得宜效果，請勿重複使用工作溶液。

7.清潔和覆蓋：將載玻片在100％乙醇中脫水約10分鍾 ×4次。 在二甲苯或二甲苯替代物中清洗約10分鍾 ×3次。 蓋玻片采用的是Permount®封片劑。

將superGolgi-染色用的切片儲(chu) 存在室溫和黑暗區域。