一、技術方案
•小鼠血小板表麵糖蛋白的流式細胞術分析
•免疫組織化學（采用丙酮固定的冰凍切片）
•免疫沉澱
•免疫印跡（蛋白質印跡分析）
二、小鼠血小板表麵糖蛋白的流式細胞術分析
（1）緩衝(chong) 液和試劑
•Tris 緩衝(chong) 鹽水 / 肝素（TBS/Hep）：20 mM Tris/HCl；137 mM NaCl；pH 7.3；含 20 U/ml 肝素。
•磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水（PBS）：137 mM NaCl；2.7 mM KCl；1.5 mM KH₂PO₄；8 mM Na₂HPO₄；pH 7.14。
•Tyrode's 緩衝(chong) 液（改良型）：134 mM NaCl；0.34 mM Na₂HPO₄；2.9 mM KCl；12 mM NaHCO₃；20 mM Hepes；pH 7.0；5 mM 葡萄糖；0.35%（w/v）牛血清白蛋白。
•腺苷三磷酸雙磷酸酶（Apyrase）：10 U/ml 儲(chu) 備液（溶於(yu) 雙蒸水，-20℃保存）。
•前列環素（前列腺素 I₂，PGI₂）：1 mM 儲(chu) 備液（溶於(yu) 雙蒸水，-20℃保存）。
•CaCl₂：1 M 儲(chu) 備液（溶於(yu) 雙蒸水）。
（2）稀釋或洗滌全血的製備
1.用肝素化玻璃毛細管（如 ringcap）從(cong) 眼眶後叢(cong) 采集 50ul 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 試管中。
2.用 1 ml Tyrode's 緩衝(chong) 液稀釋，用於(yu) 流式細胞術分析。
3.若要製備 “洗滌過的血液"：將稀釋血液以 900×g離心 5 分鍾，棄上清，將沉澱重懸於(yu) 1.25 ml Tyrode's 緩衝(chong) 液中。
4.實驗開始前，直接加入 1 mM CaCl₂。
注意：對於(yu) 凝血酶誘導的血小板活化，需去除血漿以避免抗凝血酶活性的幹擾。
（3）洗滌小鼠血小板的製備
“洗滌血小板" 的製備耗時更長，但需要更多血液，且所得血小板製品可使用數小時。
1.用 1.5 cm 玻璃毛細管從(cong) 眼眶後叢(cong) 采集 0.5–1 ml 血液，加入含 200ul TBS / 肝素（20 U/ml）的 1.5 ml 試管中。
2.樣本以 500×g離心 5 分鍾，將 ** 富含血小板的血漿（PRP）** 轉移至新試管（為(wei) 回收血小板，需取包含所有紅細胞的完整白色層）。
3.將血小板懸液以 300×g離心 8 分鍾，將無紅細胞的 PRP 轉移至新試管。
4.加入 0.5uM 前列環素（PGI₂），以 1300×g離心 5 分鍾。
5.將血小板沉澱重懸於(yu) 1 ml Tyrode's 緩衝(chong) 液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸雙磷酸酶和 0.5uM 前列環素，37℃孵育 5 分鍾後，以 1300×g離心。
6.重複步驟 5：將血小板沉澱重懸於(yu) 0.5 ml Tyrode's 緩衝(chong) 液，加入 0.02 U/ml 腺苷三磷酸雙磷酸酶，37℃孵育 30 分鍾。
（4）血小板表麵糖蛋白的單色分析
1.將 5ul特異性抗體(ti) 或陰性對照抗體(ti) 與(yu) 25ul “稀釋全血" 或 “洗滌過的血液" 加入測定管，渦旋振蕩 1–2 秒。
2.室溫孵育 15 分鍾。
3.加入 400ul PBS 終止反應，並在 30 分鍾內(nei) 完成分析。
（圖示說明：樣本按上述方法與(yu) FITC 偶聯的對照 IgG（黑線）、抗 - GPVI 或抗 - GPV 孵育。通過 “ 前向散射（FSC）/ 側(ce) 向散射（SSC）特征對血小板設門；設門（R1）血小板的熒光 1（FL1）"強度在單獨直方圖中顯示。RBC：紅細胞。）
（5）血小板活化的雙色分析
1.向測定管中加入 5ul特異性抗體(ti) 或陰性對照抗體(ti) ，同時加入 5ul泛血小板標誌物。
2.此時可加入小體(ti) 積（<5ul）額外試劑（如抑製劑）。
3.加入 25ul “稀釋全血"“洗滌過的血液" 或 “洗滌過的血小板（1×10⁶個(ge) ）"，渦旋振蕩 1–2 秒。
4.室溫孵育 15 分鍾；加入 400ul PBS 終止反應，並在 30 分鍾內(nei) 完成分析。
（圖示說明：洗滌後的小鼠血小板與(yu) PBS（靜息組）或凝血酶（0.1 U/ml），以及 FITC 和 PE 偶聯的單克隆抗體(ti) （mAbs）共同孵育。通過GPIX 或 GPIIbIIIa 的表達對血小板設門（FL1；gate 1）。）
三、免疫組織化學（采用丙酮固定的冰凍切片）
請注意：不建議對（多）聚甲醛固定的樣本進行免疫染色 —— 因為(wei) 大多數大鼠抗體(ti) 在小鼠組織上的染色效果較差。
1.將冰凍組織切片貼於(yu) 載玻片，4℃下用冰冷的 100% 丙酮固定 20 分鍾；室溫下幹燥樣本過夜。
2.為(wei) 減少試劑用量，可用防水筆在載玻片的組織切片周圍畫 “疏水環"；後續所有步驟中，該環內(nei) 區域不得幹燥，因此建議在濕盒中進行孵育。
3.切片在 PBS 中孵育 20 分鍾。
4.若使用過氧化物酶偶聯的二抗：將切片與(yu) 0.03% H₂O₂在室溫下孵育 10 分鍾（抑製內(nei) 源性過氧化物酶活性），再用 PBS 衝(chong) 洗切片 3 次（每次 5 分鍾）。
5.切片在封閉液（二抗宿主物種的血清，用 PBS 按 1:10 或 1:100 稀釋）中室溫孵育 1 小時。
6.用封閉液稀釋的一抗（2–10ug/ml）覆蓋切片，室溫孵育 2 小時。
7.用 PBS 衝(chong) 洗切片 3 次（每次 5 分鍾）。
8.用熒光團偶聯或過氧化物酶偶聯的二抗（如親(qin) 和純化的驢抗大鼠 IgG-FITC 或 - HRP，按製造商說明用封閉液稀釋）覆蓋切片，室溫孵育 1 小時。
9.吸去多餘(yu) 液體(ti) ，用 PBS 衝(chong) 洗 3 次（每次 5 分鍾）。
10.a）熒光染色的樣本可直接用熒光顯微鏡分析。
11.b）若要顯示 “過氧化物酶標記的結構"：用新鮮製備的3 - 氨基 - 9 - 乙基哢唑（AEC）底物覆蓋切片，孵育至顯微鏡下可見紅色染色（時間 5–30 分鍾不等）；在出現橙色背景染色前，用去離子水衝(chong) 洗終止反應。如需複染，將樣本與(yu) 蘇木精孵育 30–240 秒，再用流動溫水衝(chong) 洗切片 20 分鍾；最後用水性包埋液封片。
四、免疫沉澱
（1）緩衝(chong) 液和試劑
•PBS/EDTA：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH₂PO₄，8.0 mM Na₂HPO₄・2H₂O，pH 7.3；含 5 mM EDTA。
•IP 緩衝(chong) 液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，2 mM PMSF，10ug/ml 亮抑酶肽，10ug/ml 抑肽酶，1ug/ml 胃蛋白酶抑製劑。
•Igepal：10% 儲(chu) 備液（溶於(yu) 雙蒸水）。
•2×SDS - 樣本緩衝(chong) 液：10%β- 巰基乙醇（用於(yu) 還原緩衝(chong) 液），10% Tris 緩衝(chong) 液（1.25 M），20% 甘油，4% SDS，0.02% 溴酚藍。
（2）操作步驟
1.洗滌小鼠血小板或細胞（每次免疫沉澱用 1×10⁷個(ge) ）3 次：每次用 1 ml PBS/EDTA，5 分鍾，1300×g；然後重懸於(yu) IP 緩衝(chong) 液。
2.加入 1% Igepal，室溫裂解血小板 15–20 分鍾。
3.以 10,000×g離心 5 分鍾去除細胞碎片，將上清液轉移至新管。
4.加入 20ul“ 洗滌過的蛋白 G 瓊脂糖（PGA）" 進行 “預清除"，4℃孵育至少 3 小時。
5.樣本以 3,000×g離心 5 分鍾；將上清液轉移至新管，加入 “數據表指定濃度的抗體(ti) "（通常 2–5ug/ml），30 分鍾後加入 25ul 洗滌過的 PGA；4℃下旋轉孵育至少 2 小時（最好過夜）。
6.洗滌沉澱物：樣本以 3,000×g離心 1 分鍾；向 PGA 沉澱中加入 1 ml 含 1% Igepal 的 1×IP 緩衝(chong) 液，再以 3,000×g離心 1 分鍾。
7.用 plain IP 緩衝(chong) 液洗滌 PGA 沉澱 2 次（每次 1 分鍾，3,000×g）。
8.將沉澱重懸於(yu) 25ul 1×SDS 樣本緩衝(chong) 液（還原或非還原型），煮沸 5 分鍾；樣本可冷凍（-20℃）備用，或用於(yu) SDS-PAGE 及後續免疫印跡分析。
五、免疫印跡（蛋白質印跡分析）
（1）緩衝(chong) 液和試劑
•裂解緩衝(chong) 液：40 mM Tris/HCl，0.3 M NaCl，1 mM EDTA，0.05% NaN₃，1% Igepal。
•PBS：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH₂PO₄，8.0 mM Na₂HPO₄·2H₂O，pH 7.3。
•PBS-5% 牛奶：含 5% 非脂幹奶的 PBS。
•PBST：含 0.1% Tween 20 的 PBS。
•PBST-1% 牛奶：含 1% 非脂幹奶的 PBST。
（2）操作步驟（所有步驟可在室溫下進行）
1.用裂解緩衝(chong) 液製備小鼠血小板或細胞的裂解物，與(yu) （2×）SDS 樣本緩衝(chong) 液在 95℃孵育 5 分鍾。
2.通過 "SDS - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）"分離蛋白質（還原或非還原條件，依數據表說明），然後將蛋白質轉移至 PVDF 膜。
3.用 PBS-5% 牛奶封閉膜，振蕩孵育1 小時。
4.用含 2–5ug/ml 一抗的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振蕩 1 小時。
5.用 PBST 衝(chong) 洗膜 2 次，再用 PBST 洗滌 2 次（每次 30 分鍾）；洗滌程序可簡化為(wei) “每次 10 分鍾，共 3 次"，但需單獨驗證。
6.用含 HRP 偶聯抗大鼠 IgG 的 PBST-1% 牛奶孵育膜，振蕩 45–60 分鍾。
7.用 PBST 衝(chong) 洗膜 2 次，再用 PBST 洗滌 2 次（每次 30 分鍾）。
8.用 "ECL（增強化學發光）"顯示結合的抗體(ti) 。
關(guan) 鍵詞：血管研究抗體(ti) 、小鼠血小板流式細胞術、血小板表麵糖蛋白、免疫組織化學丙酮固定、血小板活化分析、免疫沉澱技術、免疫印跡Western Blot、止血血栓研究工具、Tyrode's緩衝(chong) 液、腺苷三磷酸雙磷酸酶、前列環素PGI₂、富含血小板血漿PRP、血小板設門FSC/SSC、雙色流式細胞術、冰凍切片免疫組化、3-氨基-9-乙基哢唑AEC、IP緩衝(chong) 液、SDS-PAGE電泳、PVDF膜轉印、ECL化學發光、凝血酶誘導血小板活化、肝素化血液采集、血小板洗滌方法、泛血小板標誌物、抗GPVI抗體(ti) 、抗GPV抗體(ti) 、抗GPIX抗體(ti) 、抗GPIIbIIIa抗體(ti) 、亮抑酶肽抑肽酶、蛋白質裂解緩衝(chong) 液
（注：本文內(nei) 容基於(yu) 品牌公開資料及行業(ye) 常規信息整理，具體(ti) 以品牌信息文檔為(wei) 準。）
電話
QQ掃一掃
