Covalent binding for robust共價結合

• 共價(jia) 結合，可實現穩健，可靠，可重複的側(ce) 向流動分析

nanoComposix是精密工程和高度特征化納米粒子製造商。我們(men) 的使命是幫助我們(men) 的客戶將納米技術產(chan) 品推向市場。我們(men) 的多學科技術團隊提供快速原型設計，表征，集成和擴展解決(jue) 方案，以加速各種應用領域的研發和商業(ye) 化，包括生物診斷，局部治療，納米醫學，抗菌塗層和色彩工程。

自2004年以來，nanoComposix已為(wei) 數千名客戶提供單分散和非團聚金屬和金屬氧化物納米材料。數百種不同的材料，尺寸，形狀和表麵可供選擇，我們(men) 已經生產(chan) 了2000多種定製的核/殼，生物功能化，熒光和磁性納米複合材料，以滿足客戶的要求。NanoComposix生產(chan) 了NIST納米銀參考材料，我們(men) 的顆粒已被用於(yu) 400多篇同行評審的出版物中。我們(men) 所有的材料都提供分析證書(shu) ，包括電子顯微鏡，流體(ti) 動力學直徑和每批次的光學數據，以保證產(chan) 品符合規格。合同製造的規模從(cong) 小燒杯到數千升不等。用於(yu) 醫療設備和臨(lin) 床試驗的納米材料在我們(men) 的ISO13485和cGMP兼容潔淨室設施中生產(chan) 。通過利用我們(men) *的納米材料庫，我們(men) 的目標是幫助客戶快速將納米技術產(chan) 品從(cong) 概念轉化為(wei) 商業(ye) 化。

側(ce) 流檢測是一種快速、獨立的診斷試驗，可以檢測出各種分析物.該測試價(jia) 格低廉，攜帶方便，可在常溫下儲(chu) 存，並有很長的貨架壽命。 e.該分析提供診斷結果，不需要樣品處理或額外設備，使這種格式為(wei) 理想的護理點和現場診斷。每一個(ge) 側(ce) 麵的關(guan) 鍵部件 W檢驗是用分子識別元件(通常是抗體(ti) )塗層的檢測器粒子。在橫向流動檢測中常用的一種檢測粒子是金納米粒子wh。 Ich有非常大的吸收截麵，使它們(men) 在綁定到測試行時易於(yu) 可視化(參見圖1)。製備金共軛探測器粒子的分子識別方法 ENT必須與(yu) 金顆粒的表麵結合。一個(ge) 創建這些抗體(ti) 綴合物的方法是簡單的混合顆粒的金納米粒子和抗體(ti) 結合在一起，使抗體(ti) 通過物理吸附與(yu) 金納米顆粒表麵結合。雖然這通常是成功的，但每一種生理吸附結合都必須根據鹽濃度、pH和抗體(ti) /部分進行優(you) 化。 柱比在某些情況下，抗體(ti) 與(yu) 粒子表麵的結合較弱，抗體(ti) 可與(yu) 表麵解離，有可能破壞粒子的穩定或降低pa。 質膜對分析物的結合親(qin) 和力。另一種將抗體(ti) 與(yu) 粒子表麵結合的方法是使用共價(jia) 化學。共價(jia) 結合提供了許多優(you) 點 clouding暗晦，濕潤，

在更大範圍的樣本矩陣中增加共軛穩定性

對粒子/抗體(ti) 比率的更大控製

減少尋找適合抗體(ti) 對所需的共軛反應次數

本白pi書(shu) 提供了關(guan) 於(yu) 如何通過共價(jia) 結合形成健壯和可靠的抗體(ti) 結合的附加信息。

共價(jia) 結合粒子

納米複合物為(wei) 共價(jia) 結合提供了三種不同的生物製備納米粒子：40 nm直徑的金納米球，80 nm直徑的金納米球和150 nm直徑的金納米。粒子Ar E功能化的脂聚乙二醇酸(用於(yu) 納米球)或硫辛酸(用於(yu) 納米)，以產(chan) 生一個(ge) 強大的羧基表麵，共價(jia) 結合在選定的靶向劑上的遊離胺。共價(jia) 酰胺鍵之間的羧基和自由胺是通過EDC/Sulfo-NHS中間實現的(圖2)。對於(yu) 抗體(ti) 來說，賴氨酸殘基是EDC/NHS結合的主要靶位點。一個(ge) 典型IgG抗體(ti) 有80~100個(ge) 賴氨酸殘基，其中30~40個(ge) 可與(yu) EDC/NHS結合。蛋白質，如牛血清白蛋白，有相似數量的可接近賴氨酸基團。 .

在共軛之前，抗體(ti) 溶液在儲(chu) 存緩衝(chong) 液中不含有額外的遊離胺是至關(guan) 重要的，因為(wei) 遊離胺將與(yu) 納米粒子上的結合位點競爭(zheng) 。f Ree胺，包括在Tris緩衝(chong) 液或防腐劑sodium azide;  中發現的，必須除去，抗體(ti) 必須轉移到合適的氨基緩衝(chong) 液中。一種常見的執行此操作的方法 洗滌步驟是使用自旋列(圖3)。此外，抗體(ti) 溶液中的任何附加穩定蛋白也必須去除。蛋白質A或其他親(qin) 和柱可用於(yu) 其他蛋白質的抗體(ti) 。蛋白質純化應該首先進行，因為(wei) 從(cong) 親(qin) 和柱中洗脫抗體(ti) 通常需要使用含有胺的緩衝(chong) 液。潛艇 然後需要將抗體(ti) 依次純化成無胺緩衝(chong) 液.抗體(ti) 純化的步驟詳見下文。

材料( material的名詞複數 )

微孔超0.5mL 10K蛋白質純化和濃縮過濾器(目錄#UFC 5096)

2毫升微離心管可容納過濾器

微型離心機

需純化的抗體(ti) (例如，每個(ge) 過濾器的抗體(ti) 為(wei) 0.1至2毫克)

·純化緩衝(chong) 液(例如10毫米磷酸鉀或其他無胺緩衝(chong) 液)

蛋白質定量用bca檢測試劑盒和平板閱讀器或紫外-可見分光度計

淨化協議

在微離心管內(nei) 放置過濾器。

加入450升純化緩衝(chong) 液，在13.8K RCF離心5分鍾，預衝(chong) 洗濾池。

將濾液處理到管子底部。

ALI抗體(ti) 溶液進入過濾器並關(guan) 閉蓋子。該過濾器可容納500微升，如果淨化體(ti) 積超過這一能力，離心機濃縮和添加更多的未純化抗體(ti) 之前。 繼續清洗步驟。如果初始抗體(ti) 量小，則加入緩衝(chong) 液，可達~450μL的總體(ti) 積。

用13.8K RCF離心5分鍾濃縮。

從(cong) 微離心管中取出含有濃縮抗體(ti) 的過濾器。從(cong) 微離心管底部取出濾液。

注：濾液可從(cong) 清潔容器內(nei) 的所有洗滌步驟中保留下來。如果由於(yu) 穿透濾池而產(chan) 率特別低，則可從(cong) 保留的濾液中回收抗體(ti) 。

將含有濃縮抗體(ti) 的過濾器放回試管中，並在濾池中加入350毫升的純化緩衝(chong) 液。

在13.8K RCF離心5分鍾，洗滌/濃縮。

重複洗滌程序(步驟5-7)，再用350毫升的額外淨化緩衝(chong) 液洗滌四次，共洗滌五次。

後一次清洗後，將設備倒轉到一個(ge) 新的，清洗2毫升微離心管，並切斷蓋子。在1k RCF離心5 min，收集純化和濃縮抗體(ti) 。奧普提 Mal恢複，立即進行反向旋轉。

將抗體(ti) 溶液後濃度為(wei) ≥1mg/mL保存。純化後，典型的推薦儲(chu) 存方法是將純化的抗體(ti) ≥1 mg/mL保存在螞蟻的基礎上。 供應商的分析證明。一般來說，應避免凍結/解凍循環。關(guan) 於(yu) 建議的儲(chu) 存和處理程序，請參考抗體(ti) 供應商的說明。

確定終蛋白質濃度

現在你已經純化了你的抗體(ti) ，確定終的蛋白質濃度是很重要的。這可以通過一種基於(yu) SPECT中280 nm處溶液吸光度的方法來實現。 分光度法(A 280法)或二異氰酸酯(BCA)法。

1. 大樣本回收率

2. 精礦中樣品回收率低可能是由於(yu) 吸附損失、濃度過高或樣品通過膜造成的。若要大限度地提高樣品回收率，請確保吸管針尖不起作用。 他沒有刺破濾膜。吸附損失取決(jue) 於(yu) 溶質濃度、疏水性、溫度、與(yu) 過濾裝置表麵的接觸時間、樣品組成和pH值。到 盡量減少損失，離心後立即取出濃縮樣品。如果起始樣品濃度較高，請監測離心過程，以避免過濃。 樣本。過量的濃度會(hui) 導致沉澱和潛在的樣品損失.如果樣品似乎通過膜，選擇一個(ge) 較低的名義(yi) 相對分子質量限製(NMWL)amico。 n超-0.5濾波器單元。收集濃縮/純化抗體(ti) 後，可用少量純化緩衝(chong) 液衝(chong) 洗濾池內(nei) 幾次，回收任何抗體(ti) t。 帽子可能在濾膜上。

3. 結合協議：步驟2：抗體(ti) 結合

4. 抗體(ti) 可以通過碳二亞(ya) 胺交聯化學(EDC)與(yu) 納米顆粒表麵的端羧基結合。EDC與(yu) 羧酸基團反應 形成活性酯中間體(ti) 。磺化NHS的加入提高了中間體(ti) 的溶解度和穩定性，該中間體(ti) 與(yu) 抗體(ti) 的胺基團發生反應，形成穩定的酰胺鍵Be。 抗體(ti) 和納米粒子之間。下麵的方法描述了羧基功能化納米粒子的抗體(ti) 結合步驟。

5. 所需材料

6. 40 nm直徑生物製備羧基金納米粒子

7. 不加任何遊離胺的純化抗體(ti)

8. 反應緩衝(chong) 液(5毫米磷酸鉀，0.5%20 KmW PEG，pH 7.4)

9. European Defence Community歐洲防務集團

10. 羥基硫代琥珀酰亞(ya) 胺

11. 猝滅劑（50%（W/V）羥胺）

12. 共軛稀釋劑(0.1x PBS，0.5%BSA)

13. 離心機

14. 標準微離心管(沒有特殊處理或殘留增塑劑)

15. [航]渦流

16. 旋轉者，轉動體(ti)

17. 共軛協議

18. 提出了40 nm直徑羧基金納米粒子在OD 20處1mL的共軛策略，在OD 20處產(chan) 生1mL的抗體(ti) -金共軛物。適用於(yu) 較大或較小的體(ti) 積 MES，比例按比例或遵循特定的共軛協議提供的每個(ge) 生物反應的羧基變體(ti) 。

19. 重要事項：步驟1-6應在溶解EDC/Sulfo-NHS後立即完成，以盡量減少Sulfo-NHS酯在水中的水解，並提高共軛效果。

20. 在接枝前用10 mg/mL的H2O製備EDC和Sulfo-NHS。

21. 小貼士：確保EDC和磺胺類NHS試劑在打開小瓶前保持室溫。在每個(ge) 微離心管中分別稱重1-10毫克EDC和磺基NHS。就在前麵 在適當體(ti) 積的H2O中溶解，使其濃度達到10 mg/mL。

22. 例子：EDC質量=2.38mg，添加238 LH2O質量為(wei) Sulfo-NHS=6.14毫克，添加614升H2O

23. 在40 nm羧基金納米粒子的1mL中加入200μg的EDC(20 L新鮮製備的EDC，在H2O中10 mg/mL)和400 g的Sulfo-NHS(40 L的新製備的Sulfo-NHS，在H2O中濃度為(wei) 10 mg/mL)。

24. 漩渦溶液在室溫下旋轉30分鍾

25. 在3600 RCF離心10分鍾。

26. 小心移除上清液，去除任何過量的EDC/Sulfo-NHS，並在1mL反應緩衝(chong) 液中重新懸浮。旋渦和(或)聲波使粒子*重新懸浮。

27. 加入抗體(ti) 和漩渦溶液。

28. 旋轉時，在室溫下孵育2小時。請注意，較短或較長的孵育時間可能會(hui) 提高結合的效果。

29. 孵化後，添加10升昆徹，以使任何剩餘(yu) 的NHS-酯類物質失活.旋轉時，在室溫下旋轉10分鍾。

30. 在3600 RCF離心10分鍾。小心去除上清液，並在1mL反應緩衝(chong) 液中重新懸浮.旋渦和/或聲納以*重新懸浮共軛。

31. 重複離心和再懸浮以去除多餘(yu) 的抗體(ti) 。

32. 再在3600 RCF離心10分鍾，取出上清液，用共軛稀釋劑使體(ti) 積達到1mL。旋渦和/或聲納以*重新懸浮共軛。

33. 在4°C保存共軛物，不要凍結。

優(you) 化共軛的附加提示

需要注意的是，宜的結合步驟是依賴於(yu) 抗體(ti) 的，並且抗體(ti) 之間的優(you) 化技術會(hui) 有所不同。共軛物在溶液中應該是穩定的，並且 與(yu) 抗原有效而特異的結合。以下提示可以提高共軛的效率：

在pH值為(wei) 5的條件下，EDC和Sulfo-NHS對羧酸基團的活化效果適。

當pH值為(wei) 7~7.5時，伯胺對抗體(ti) 與(yu) 活性羧基發生反應的pH值高。在較高的pH值下進行反應，大大降低了.的半衰期。 NHS-酯中間體(ti) 。

結合過程中抗體(ti) 的濃度和抗體(ti) 與(yu) 納米粒子的孵育時間可進行調節，以確定宜條件。

共軛稀釋劑組分可以調整，以確定宜緩衝(chong) 摩爾度，pH，阻滯劑，聚合物和表麵活性劑。

共軛協議：步驟3：描述共軛

對共軛物的表征對於(yu) 確保抗體(ti) 結合在粒子表麵和共軛物是穩定的是至關(guan) 重要的。紫外可見光譜儀(yi) 是一種可以利用的工具。 ED通過觀察等離子體(ti) 共振吸收來評價(jia) 其穩定性。納米粒子在共軛前後的共振峰位置有輕微的變化，表明抗體(ti) 具有 成功地與(yu) 表麵結合。如果共軛物聚集，峰移並變得更寬（圖4）。動態光散射是另一種可用於(yu) 篩選SMA的工具。 通過測定流體(ti) 力學尺寸和多分散性指數，得到聚集量。橫向流動試驗條也是評價(jia) 共軛性能的一種有效方法，同時也是一種輔助手段。 申請這樣的結合。側(ce) 流測試條可以含有與(yu) 納米顆粒結合的抗體(ti) 的特異性試劑，並提供了一種快速、簡便的檢測方法。 研究抗體(ti) 是否成功結合並保持功能。

批量大小和每條帶鋼的價(jia) 格

生物製備羧基粒子是在納米複合材料的ISO 13485符合質量體(ti) 係，確保高批號-批次一致性的粒子性質。地段大小可達400，000 OD-MLS( 相當於(yu) 1 OD金400 L)，單批可產(chan) 生約1，000，000條。在供應合同中，客戶可以保留特定的批次，以便在一年內(nei) 從(cong) 同一批中取樣。 ，在切換到新批次時，由於(yu) 重新優(you) 化而減少任何停機時間。大量生產(chan) 也使我們(men) 能夠以競爭(zheng) 力的價(jia) 格提供具有廣泛特色的產(chan) 品。什麽(me) 時候 比較供應商定價(jia) ，重要的是要調整為(wei) 不同數量和不同濃度供應的價(jia) 格。為(wei) 了規範定價(jia) ，我們(men) 通常用OD-mL來討論成本。 簡單的價(jia) 格除以產(chan) 品的OD溶液和體(ti) 積。例如，如果在10 OD濃度下，100 mL體(ti) 積的金納米粒子的成本為(wei) 600美元，那麽(me) 每OD-mL的成本為(wei) 600美元。 /(100*10)=0.60美元。與(yu) 其他許多供應商不同，我們(men) 的共價(jia) 耦合解決(jue) 方案具有*的成本效益，終成本僅(jin) 略高於(yu) 物理吸附產(chan) 品的成本。 離子。當您考慮到開發時間更快、在各種樣品介質中更穩定、每個(ge) 粒子的抗體(ti) 使用量更低、以及更好地控製抗體(ti) /粒子的優(you) 點時， e比率，在許多情況下，使用共價(jia) 結合可以降低淨成本和提高性能。

請隨時與(yu) 我們(men) 的銷售人員聯係，提供報價(jia) 或獲得更多的共價(jia) 綁定幫助。

結論

我們(men) 的生物準備羧基金是一種簡單和成本效益的方法，以創造敏感，穩健和可靠的金共軛物。我們(men) 有許多客戶無法做出穩定的共軛w。 被動吸附，但與(yu) 共價(jia) 結合成功。在競爭(zheng) 性橫向流動測試中，顆粒表麵的抗體(ti) 數量對於(yu) 調節動力至關(guan) 重要。 C值範圍內(nei) ，共價(jia) 結合增加了對顆粒/抗體(ti) 比值的控製。由於(yu) 共價(jia) 結合比被動吸附更有效，抗體(ti) 量的減少 當使用昂貴的抗體(ti) 時，需要建立一個(ge) 測試可以導致化驗成本的淨減少。在我們(men) 手中，共價(jia) 結合的優(you) 點是快速清除抗體(ti) PAI的能力。 由於(yu) 不再需要掃描每個(ge) 納米粒子共軛物的鹽和pH，因此標準的EDC/NHS結合條件通常是次起作用。如果你還沒試過Coval 目前還沒有綁定，請與(yu) 我們(men) 聯係，以幫助粒子選擇和綁定化學協議和支持。

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